М 5: BMW M5 серии на официальном сайте BMW в России

Содержание

Технические характеристики BMW M5 Седан VI (F90)

Черный (Чёрный Сапфир металлик)

Индивидуальный цвет

Серый (Серый Сингапур)

Серый (Серый Сингапур)

Синий (Синий Марина Бэй металлик)

Черный (Чёрный Сапфир металлик)

Синий (Синий Марина Бэй металлик)

Серый (Серый Сингапур)

Красный (Individual Wildberry)

Синий (Синий Марина Бэй металлик)

Серый (Серый Сингапур)

Средство для мытья посуды в посудомоечной машине Мега М 5 л (концентрат)

Низкопенное средство для посудомоечных машин Мега М
Средство для мытья всех видов посуды в посудомоечных машинах промышленного и бытового типа. Средство концентрированное, обладает высокой моющей и обезжиривающей способностью, эффективно очищает посуду от остатков пищи. Рекомендуется для мойки керамической, фарфоровой, стеклянной и фаянсовой посуды, а так же посуды из пластмассы и нержавеющей стали. Эффективно работает в воде любой жесткости и температуры. Не вызывает коррозии оборудования. Рекомендуется использовать вместе с ополаскивателем МЕГА ОП.
Область применения:
-предприятия пищевой промышленности
-административные и общественные здания
-учебные и медицинские учреждения
-предприятия торговли и общественного питания
-гостиницы и рестораны
-профессиональный клининг
Особенности:
-подходит для любых типов посудомоечных машин
-обладает высокой моющей и обезжиривающей способностью
-подходит для всех видов посуды
-эффективно в воде любой температуры и жесткости
Рекомендации по применению:
Мытье посуды в посудомоечной машине:
Руководствуйтесь соответствующими инструкциями для посудомоечных машин. При отсутствии инструкций используйте средство в 0,05-0,5% концентрации (0,5-5 мл средства на 1 л воды). Для придания блеска после мытья используйте ополаскиватель МЕГА ОП.
Физико-химические показатели:
Состав: >30% очищенная вода, 5-15% щелочные компоненты, <5% щелочь, <5% полимер, <5% краситель.
Внешний вид: прозрачная однородная жидкость голубого цвета.
рН: 10,0-12,0 Плотность: 1,00-1,10 г/см3
Меры предосторожности: При работе использовать резиновые перчатки. Не допускать попадания средства на слизистые оболочки и кожу, в случае попадания -промыть большим количеством воды.
Хранение: Хранить в таре изготовителя с плотно закрытой крышкой при температуре от −5 до +30°C, не допускать попадания прямых солнечных лучей. Средство замерзает, после размораживания восстанавливает свои физико-химические свойства и моющую способность. Рекомендуется после размораживания перемешать встряхиванием.
Гарантийный срок хранения: 24 месяца со дня изготовления.

Трасса М5 «Урал»

км Легенда трассы: города, интересные места, гостиницы, кафе Рейтинг н/п Информация о состоянии трассы
0 Москва 13070.80 на дату 5.2015
скорость выше 90
17 Дзержинский 278.69 на дату 5.2015
скорость выше 90
25 Лыткарино 62.94 на дату 5.2015
скорость выше 90
30 Верхнее Мячково 10.37 на дату 5.2015
скорость выше 90
34 Михайловская слобода 30.74 на дату 5.2015
скорость выше 90
52 Бронницы
пересечение с трассой:
А107 от Дмитровского шоссе (по часовой стрелке)
212. 33 на дату 5.2015
скорость выше 90
81 Новотроицкое. Центральный радиолокатор наведения ЗРК С-25
83 Степанщино   на дату 5.2015
скорость выше 90
85 Непецино 55.08 на дату 5.2015
скорость выше 90
102 Коломна
пересечение с трассой:
Егорьевск — Коломна — Кашира — Ненашево
2453.83 на дату 5.2015
скорость выше 90
124 Луховицы
пересечение с трассой:
М5(Луховицы)-Зарайск
597.43 на дату 5.2015
скорость выше 90
136 Фруктовая
пересечение с трассой:
Белоомутская паромная переправа
15.59 на дату 5. 2014
скорость выше 90
162 Дивово 64.14 на дату 5.2014
скорость выше 90
170 Рыбное
пересечение с трассой:
Константиново-Рыбное-Глебово Городище
71.36 на дату 5.2014
скорость выше 90
174 Ливонка   на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
189 Рязань
пересечение с трассой:
Рязань-Спасск
Рязань — Ряжск — Ефремов
Спас-Клепики — Рязань
Калуга — Тула — Михайлов — Рязань
Скопин-Рязань
1817.86 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
244 Перевлес. Церковь Рождества Пресвятой Богородицы
253 Кирицы 85. 60 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
265 Старая Рязань
271 Срезнево. Музей академика И.И.Срезневского
277 Лунино. Усадьба Лунино
289 Шилово
пересечение с трассой:
Ряжск-Шилово-Касимов
49.25 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
364 Шацк
пересечение с трассой:
Тамбов — Шацк
Шацк — Касимов
Ухолово-Сараи-Шацк
2.11 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
380 Лесное Конобеево
пересечение с трассой:
М5(Конобеево)-Выша
15.63 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
395 Ямбирно
пересечение с трассой:
М5(Ямбирно) — Р124(Алешино)
  на дату 9. 2013
скорость от 60 до 90
413 Матвеевское. Дом-музей А.С. Новикова-Прибоя
429 Умет. Домашние кафе
461 Зарубкино
пересечение с трассой:
Саранск — Краснослободск — Новые Выселки
  на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
481 Спасск 2.35 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
524 Кувак-Никольское
пересечение с трассой:
М5(Кувак-Никольское)-Вадинск-Рахмановка
  на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
539 Нижний Ломов
пересечение с трассой:
М5(Нижний Ломов) — Наровчат
4.31 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
595 Мокшан 18. 05 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
612 Рамзай 31.43 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
649 Пенза
пересечение с трассой:
Кирсанов — Пенза
Пенза-Оленевка
Пенза-Шемышейка
Ольгино (Нижний Новгород) — Арзамас — Пенза — Саратов
Пенза-Ахуны-Золотарёвка-Мордовский Ишим
505.84 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
664 Чемодановка 0.00 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
679 Трофимовка. Музей кузнеца Шумарина
699 Городище
пересечение с трассой:
Никольск (Казарка)-Городище-Мордовский Ишим
0.00 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
729 Поворот на Русский Камешкир
пересечение с трассой:
М5 — Русский Камешкир
  на дату 9. 2013
скорость от 60 до 90
744 Махалино
пересечение с трассой:
Р158(Чамзинка)-Инза-М5(Махалино)
-0.59 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
769 Кузнецк. Гостиница «Кузнецк»
810 Николаевка. Памятник «Катюше»
841 Канадей. Канадейская башня
881 Сызрань
пересечение с трассой:
Сызрань — Саратов — Волгоград
Цивильск — Ульяновск-Сызрань
127.36 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
934 Переволоки. Гостиничный комплекс «Итиль»
997 Тольятти
пересечение с трассой:
Р178 (Новая Майна) — Тольятти
440. 57 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
1020 Жигулёвск 20.36 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
1030 Волжский 5.60 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
1058 Самара
пересечение с трассой:
Волгоград-Саратов-Самара (участок от Ровного)
Самара — Бугуруслан
Самара-Нефтегорск
1079.62 на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
1095 Красный Яр
пересечение с трассой:
Саранск — Сурское — Ульяновск
  на дату 9.2013
скорость от 60 до 90
1363 Октябрьский. Гостиница «Девон»
1443 Амирово
пересечение с трассой:
М5(Амирово)-М7(Дюртюли)
  на дату 5. 2019
скорость от 60 до 90
1500 Чишмы 38.13 на дату 5.2019
скорость от 60 до 90
1539 Уфа
пересечение с трассой:
Горьковское шоссе
Уфа — Оренбург
457.33 на дату 5.2019
скорость от 60 до 90
1610 Аша 37.83 на дату 5.2019
скорость от 60 до 90
1745 Сатка 49.85 на дату 5.2019
скорость от 60 до 90
1789 Златоуст
пересечение с трассой:
М5 (Тюбук)-Касли-Златоуст
204.79 на дату 5.2019
скорость от 60 до 90
1816 Черновское
пересечение с трассой:
Тургояк-Миасс-Черновское(М5)
  на дату 5. 2019
скорость от 60 до 90
1919 Челябинск
пересечение с трассой:
Челябинск — Курган — Петропавловск — Омск — Новосибирск
Челябинск-Троицк
416.31 на дату 7.2013
скорость выше 90
2024 Красный Партизан. Останцы на озере Большие Аллаки
2029 Тюбук
пересечение с трассой:
М5 (Тюбук)-Касли-Златоуст
  на дату 7.2015
скорость от 60 до 90
2077 Сысерть 52.18 на дату 7.2015
скорость от 60 до 90
2100 Арамиль -1.99 на дату 7.2015
скорость от 60 до 90
2121 Екатеринбург
пересечение с трассой:
Екатеринбург-Пермь-М7(Игра)
Екатеринбург — Нижний Тагил — Серов
Екатеринбург-Алапаевск
Екатеринбург-Тюмень
Екатеринбург-Курган
Екатеринбург — Полевской
1106. 27 на дату 7.2015
скорость от 60 до 90

45-мм противотанковая пушка М-5 . Опытный образец 1942 года. СССР

Использование на заключительном этапе Второй мировой войны германским вермахтом новых танков и самоходных артиллерийских установок с усиленным бронированием (особенно лобовым), привело к резкому снижению эффективности советских 45-мм и 57-мм противотанковых орудий. Красная Армия нуждалась в более мощной противотанковой пушке, что и послужило основной причиной продолжения опытно-конструкторских работ по созданию новых образцов подобных малокалиберных противотанковых орудий.

В 1944 году в КБ Мотовилихинского артиллерийского завода № 172 (г. Пермь) была создана 76-мм полковая пушка М-3-1 (спроектированная по схеме трофейной германской противотанковой пушки 75/55-мм РАК.41), и имевшая несущий щит, заменивший нижний лафет. Полигонные испытания опытного образца пушки М-3-1 проводились в ноябре 1944 года. А уже вскоре, в 1945 году, на ее базе была сконструирована новая 45-мм противотанковая пушка М-5. Она была создана посредством наложения ствола-моноблока с полуавтоматическим горизонтальным вертикальным затвором от пушки М-42 на легкий двухколесный щит-лафет с коробчатыми станинами, на котором монтировался.

Наиболее важным конструктивным отличием М-5 от других малокалиберных противотанковых пушек явилось наличие несущего экранированного щита, состоявшего из двух листов — переднего, толщиной 4 мм , и заднего, толщиной 3 мм . На щите монтировались все основные части орудия: верхний станок с механизмами наведения и прицелом, раздвижные станины, торсионное подрессоривание с полуосями и дисковыми колесами с шипами. Верхний станок представлял собой шаровую маску и крепился в щите с помощью вертикальных цапф. Противооткатные устройства — гидравлический тормоз отката и пружинный накатник — были аналогичны 45-мм противотанковой пушке М-42. Подъемный и поворотный механизмы винтового типа. Станины раздвижные, сварные, коробчатого сечения, прикреплены к щиту. Орудие имело очень малую высоту линии огня — 570 мм . Масса орудия в боевом положении составляла всего 491 кг . Баллистика пушки М-5 была аналогична пушке М-42.

В боекомплект пушки входили унитарные выстрелы с бронебойными, бронебойно-трассирующими и подкалиберными снарядами, осколочными гранатами, а также унитарные выстрелы с картечью. Подобная конструкция щита-лафета 45-мм противотанковой пушки М-5 имела многочисленные преимущества перед противотанковыми орудиями с «классическими» лафетами как из-за большей компактности и простоты устройства, так и из-за меньшей массы и большей технологичности в производстве. Однако пушка все равно оставалась тяжелой для батальонного орудия, к которым относились 45-мм противотанковые пушки. Кроме того, из-за малой высоты оси орудия и значительного выноса длинного ствола во время испытаний часто происходили утыкания пушки в грунт на неровной местности при перевозке.

Усиление броневой защиты танков противника, а с другой — развитие отечественных реактивных гранатометов и безоткатных орудий лишили подобные 45-мм орудия перспективы. На вооружение Красной Армии 45-мм противотанковая пушка

М-5 принята не была.

АГНКС 2021 — Метановые заправки на Федеральной автомобильной дороге М5 «Урал»

Перечень действующих АГНКС этого региона


77
Москва, ул. Полбина, д.47а


Москва, ул. Полбина, д.47А

8 (800) 234-51-51

круглосуточно

подробнее


50
Развилка, 24-й км. МКАД


Москва, п.Развилка, МКАД, 24-й км, Каширское ш.

+7 (498) 657-80-43, +7 (495) 989-75-97

круглосуточно

подробнее


77
Москва, 15 км МКАД, внутренняя сторона


г. Москва, 15 км МКАД, внутренняя сторона, владение 2

+7 (495) 734-92-00 доп.8778, +7 (909) 935-85-80, +7 (495) 648-64-27

круглосуточно

подробнее


50
Коломна, пос. Радужный, ул. Московская, 4


Московская обл., п. Радужный, ул. Московская, строение 4 (трасса М5 Москва-Челябинск, 102 км)

+7 (496) 612-95-12, +7 (495) 648-64-27

круглосуточно

подробнее


62
Рязань, Окружная дорога, 185-й км


г. Рязань, Окружная дорога, 185-й км, строение 4

+7 (491) 255-89-46, +7 (958) 452-00-27, +7 (499) 277-00-57 (доб. 21772)

круглосуточно

подробнее


62
Рязань, ул. Радиозаводская, д.35Б


г. Рязань, ул. Радиозаводская, д.35Б

+7 (4912) 95-65-91, +7 (4912) 70-14-83

круглосуточно

подробнее


62
Рязань, п. Приокский, Промышленная улица, дом.5


Рязань, пос. Приокский, Промышленная улица, дом.5 (Рядом с заводом ТКПиО («Тяжпрессмаш» — кузнечно-прессовое оборудование)

+7 (499) 277-00-57, +7 (491) 270-14-83, +7 (910) 625-76-02

круглосучтоно

подробнее


62
Рязань, ул.Промышленная, д. 21


г.Рязань , ул.Промышленная, д.21

+7 (920) 999-50-22 , +7 (491) 277-93-80, +7 (4912) 77-93-90

круглосуточно

подробнее


58
Мичуринский, ул. 40 лет Октября, 24Г


г. Пенза, п. Мичуринский, ул. 40 лет Октября, 24 г (по ул. Бийская, 750 м от пересечения ул. Бийская и ул. 40 лет Октября)

+7 (8412) 35-02-37, 93-94-42, +7 (499) 277-00-57 (доб. 21821)

круглосуточно

подробнее


63
Самара, Уральское шоссе, 14


г.Самара, Куйбышевский район, Уральское шоссе, д. 14

+7 (846) 333-81-93, +7 (756) 61-235

круглосуточно

подробнее


63
Самара, пр. Карла Маркса, 522


г. Самара, проспект Карла Маркса, д. 522

+7 (846) 958-90-56

круглосуточно

подробнее


63
Сызрань, пос. Новая Крымза


Самарская область, Сызранский р-н, в р-не пос. Новая Крымза, 7км+500м трассы «Сызрань-Ульяновск» (М5 «Урал»)

+7 (8464) 37-33-03; +7 (756) 44-507

круглосуточно

подробнее


63
Тольятти, Автозаводское шоссе, д.10Б


Самарская область, г. Тольятти, Автозаводское шоссе, д. 10Б.

+7 (8482) 22-64-34, +7 (960) 837-88-73

круглосуточно

подробнее


63
Чапаевск, ул. Антропова, 2


Самарская, область, г. Чапаевск, пос Садово-Дачный, ул. Антропова, д. 2 / ул. Радищева

+7 (8463) 92-19-68

8:00 — 20:00

подробнее


56
Северный район, поворот с М5 на Черновку


Оренбургская обл., Северный район, а/д М5 (Москва-Челябинск» 1215 км в северо-западном направлении 300 м)

+7 (35354) 2-15-37, +7 (35354) 2-52-94

круглосуточно

подробнее


02
Октябрьский, 1287-й км трассы М-5


Республика Башкортостан, г. Октябрьский, (автодорога Уфа-Самара, 1287-й км трассы М-5)

‭8 (347) 675-04-54‬

круглосуточно

подробнее


02
Уфа, Новороссийская ул., 105В


Республика Башкортостан, г.Уфа, Новороссийская ул., 105в

+7 (987) 250–20–53, +7 (917) 800-21-05

круглосуточно

подробнее


02
Уфа, с. Михайловка, ул. Стройучасток, 39


Республика Башкортостан, г.Уфа, с. Михайловка, ул. Стройучасток, 39 (Затонское шоссе)

8 (800) 234-51-51

круглосуточно

подробнее


02
Уфа, Затонское ш., 22


Республика Башкортостан, г.Уфа, мкр.Сафроновский, Затонское шоссе, д.22 

8 (800) 234-51-51

Круглосуточно, пересменка  с 8.00-8.30 и 20.00 — 20.30

подробнее


74
Златоуст, посёлок Энергетиков, 70В


Челябинская обл, г.Златоуст, Энергетиков поселок 70В, (пос. Красная Горка 280м), с западной стороны кольца трамвайной линии на проспекте им. Ю.А. Гагарина

+7 (35136) 5-11-64, +7 (343) 312-12-02 (доб. 35421)

круглосуточно

подробнее


74
Миасс, Трактовая ул.


Челябинская обл., г.Миасс, пересечение Трактовой улицы и трассы М5 «Урал»

+7 (912) 799-92-86

круглосуточно

подробнее


74
Челябинск, ул. Автодорожная, д.8


Челябинская обл, г Челябинск, ул. Автодорожная, д.8, а/д Челябинск — Екатеринбург

+7 (351) 741-88-53, +7 (351) 753-96-12

круглосуточно

подробнее


74
Челябинск, Копейское шоссе, 1/2


Челябинская обл, г.Челябинск, Копейское шоссе, 1/2

8 (800) 700-51-51, +7 (351) 771-59-76, +7 (351) 778-52-53

круглосуточно

подробнее


74
Челябинск, ул. Северный Луч, д.9


г.Челябинск, ул. Северный Луч 9

+7 (351) 778-52-32

круглосуточно

подробнее

АСУ ТП «АССаД-М5» — Алгонт


«АССаД-М5» представляет собой распределенный аппаратно-программный комплекс и состоит из комплексов средств автоматизации (КСА) пунктов управления, объединенных вычислительной сетью. Каждый КСА представляет собой законченное функциональное изделие и в общем случае состоит серверов, процессоров управления, АРМ, сетевого оборудования, общего и специального программного обеспечения, комплекта эксплуатационной документации и ЗИП.


Для интеграции со сторонним оборудованием и программными комплексами АССаД-М5 использует специализированные аппаратно-программные интерфейсы (АПИ), поставляющиеся отдельно в соответствии с требованиями конкретного проекта. Ниже приведён перечень поставляемых на данный момент модулей СПО АПИ:


  • СПО АПИ СКУД, СОЗП, СОО на базе контроллера АЛГО-425


  • СПО АПИ СКУД, СОЗП, СОО на базе контроллера АЛГО-421


  • СПО АПИ СКУД на базе пульта вахтера 421ПВ


  • СПО АПИ СОЗП, СОО на базе блока периметрового


  • СПО АПИ периметровой СКУД на базе контроллера АЛГО-525


  • СПО АПИ автоматизированной системы биоидентификации «АССаД-ID»


  • СПО АПИ ДМС «Автодосмотр»


  • СПО АПИ СТН «АССаД-Видео»


  • СПО АПИ сети LonWorks


  • СПО АПИ системы мониторинга состояния и охраны периметра «Раскат»


  • СПО АПИ СОЗП, СОО на базе прибора «Кристалл-2С2» (2С2, 2С2. 100, 2С2.200)


  • СПО АПИ СКК, СПЗ на базе прибора «Кристалл-2С4»


  • СПО АПИ универсального интерфейсного модуля BUI-X


  • СПО АПИ СКУД СОЗП, СОО на базе контроллера «Операнд» (система «Операнд-NT»)


  • СПО АПИ СУДОС «Цирконий-М» *


  • СПО АПИ интегрированной системы охраны «Орион»


  • СПО АПИ СПЗ на базе ППКП «Рубеж-2АМ» (система «FireSec»)


  • СПО АПИ СПЗ на базе ППКОПУ «Рубеж-08»


  • СПО АПИ СТН цифрового видеомагнитофона Divar, матричного коммутатора Allegiant и мультиплексора System4 (оборудование Bosch)


  • СПО АПИ СТН на базе цифрового оборудования Geutebruck


  • СПО АПИ СТН на базе матричного коммутатора Plettac VAZ 200/300


  • СПО АПИ СТН «Фарватер –Т»


  • СПО АПИ СТН «Интеллект» (Инспектор+)


  • СПО АПИ СТН Bosch Video Management System


  • СПО АПИ СТН SecurOS


  • СПО АПИ СТН на базе видеооборудования Panasonic (видеорегистратор WJ-HD716 )


  • СПО АПИ весового терминала (ТВ-003/05Д/H, ТМ1.1.02, ЦРПА.301312.XXX)


  • СПО АПИ цифрового фотографирования (фотоаппарат Canon, IP-камера Axis, MJPEG-камера)


  • СПО АПИ пульта управления транспортным шлюзом (ЦРПА.421424.047)


  • СПО АПИ биометрического считывателя Нandkey (геометрия руки)


  • СПО АПИ биометрического считывателя ГЕОР (геометрия руки)


  • СПО АПИ блока доступа по радужной оболочке глаза «Циркон» (сетчатка глаза)


  • СПО АПИ контроллеров биоидентификации по отпечатку пальца «Био Лайт» и «Био Проф» (отпечаток пальца)


  • СПО АПИ биометрической системы BioSmart (отпечаток пальца)


  • СПО АПИ устройства контроля пропусков (Parsec PR-H/EH/P08, Н/EM-Reader-232, СБР-009/010, KCY-125-USB-i)


  • СПО АПИ ИБП на базе платы сетевого управления и мониторинга APC


  • СПО АПИ ИБП APC Smart-UPS


  • СПО АПИ СЭЗ на базе комплекта аппаратуры ЭЗМ-СМ3 (электризуемое заграждение)


  • СПО АПИ системы доступа и хранения индивидуальных ключей (электронные ключницы ПП-20, ПП-40, ПП-60)


  • СПО АПИ ИБП на базе платы сетевого управления и мониторинга Liebert IntelliSlot Web Card


  • СПО АПИ СТН «Трассир»


  • СПО АПИ модуля цифрового ввода ICP DAS серии ET/PET-7000


  • СПО АПИ системы хранения ключей СК-12, СК-24, СК-32 производства ООО «ЭВС»


  • СПО АПИ системы кондиционирования MDV (через модуль управления СРК-М2-У)


  • СПО АПИ ИБП Eaton


  • СПО АПИ устройства отображения информации (Casio XJ-M140/145/150/155/240/245/250/255/SK600, Nec P502HL/WL)


  • СПО аппаратно-программного интерфейса управления информационными табло (светодиодные табло ITLINE с Ethernet)

  • Список наркотических анальгетиков + способы применения, типы и побочные эффекты

    Наркотические анальгетики — это класс лекарств, которые используются для облегчения умеренной и сильной острой или хронической боли. Их также можно назвать опиатами, опиоидными анальгетиками или наркотиками. Анальгетик — это еще одно название лекарства, снимающего боль.

    Наркотические анальгетики — одни из наиболее широко используемых анальгетиков для снятия боли; тем не менее, ими злоупотребляли, назначали и неправильно использовали, что привело к тому, что в США проживает более двух миллионов человек.С. только страдает расстройством, вызванным злоупотреблением психоактивными веществами, включая рецептурные наркотические анальгетики.

    Наркотические анальгетики действуют путем связывания с опиоидными рецепторами, частью опиоидной системы, которая контролирует боль, приятное и вызывающее привыкание поведение. Опиоидные рецепторы более многочисленны в головном и спинном мозге, но они также расположены в других частях тела, таких как желудок и легкие. Основным опиоидным рецептором, с которым связываются наркотические анальгетики, является мю-рецептор.

    Для чего используются наркотические анальгетики?

    В прошлом наркотические анальгетики использовались при всех типах боли, что может объяснить, почему сегодня к ним пристрастилось так много людей.

    Наркотические анальгетики наиболее целесообразно использовать для облегчения кратковременной сильной боли, например, возникающей сразу после операции или вызванной заболеванием.

    Наркотические анальгетики также подходят для облегчения боли, вызванной раком, или для паллиативной помощи или ухода в конце жизни. Однако их следует рассматривать для лечения других типов хронической боли только в строгих условиях и под тщательным наблюдением.

    Чем отличаются наркотические анальгетики?

    Наркотические анальгетики различаются по своей структуре, эффективности и способу всасывания, распределения, метаболизма и вывода из организма.

    Некоторые из них, например морфин и кодеин, были первоначально получены из растений. Другие, такие как героин, гидрокодон, гидроморфон, оксикодон и оксиморфон, были получены путем модификации морфина и называются полусинтетическими. Существует три основных класса опиоидов: те, которые структурно похожи на морфин (фенантрены), те, которые напоминают фентанил (фенилпиперидины), и те, которые похожи на метадон (фенилгептиламины).

    Различные наркотические анальгетики имеют разную эффективность в зависимости от того, насколько сильно они связываются с опиоидными рецепторами (например, фентанил в 80–100 раз сильнее морфина).Это означает, что дозировки одного наркотика могут существенно отличаться от другого. Хотя существуют диаграммы преобразования (они показывают, какая доза наркотика сравнивается с эквивалентной анальгетической дозой морфина), они в лучшем случае являются лишь ориентиром, потому что другие переменные, такие как генетика человека, также играют роль в том, как человек реагирует на наркотик.

    Если наркотический анальгетик считается подходящим, сначала следует попробовать кодеин или трамадол, если боль слабая или умеренная. Если боль не реагирует на эти анальгетики или при более сильной боли, следует рассмотреть возможность применения гидроморфона, морфина или оксикодона.Фентанил и метадон следует использовать только при сильной боли, не поддающейся лечению другими наркотическими анальгетиками.

    Распространенные наркотические анальгетики, доступные в США, включают:

    Название Маршрут Начало действия Продолжительность эффекта
    альфентанил Внутривенный (IV) 90 секунд 45-60 минут
    кодеин Оральный 15-60 минут 3-4 часа
    фентанил IV Немедленно 0.5–1 час.
    Внутримышечно (IM) 7-8 минут 1-2 часа
    Буккальный (через десны)
    Сублингвальный (SL)
    5-15 минут 4-6 часов
    Пластырь трансдермальный (через кожу) 6 ч. 72-96 часов
    гидрокодон Оральный 10-20 минут 4-8 часов
    гидроморфон Оральный 15-30 минут 3-4 часа
    IV 5 минут 3-4 часа
    метадон Подкожно (SC) (под кожей) 15 минут 3-4 часа
    морфин Оральный 30-60 минут 3-6 часов (немедленное высвобождение)
    8-24 часа (расширенное высвобождение)
    IV / SC 5-10 минут 4 часа
    оксикодон Оральный 10-15 минут 3-6 часов
    оксиморфон Оральный 30-60 минут (немедленное высвобождение)
    1-2 часа (расширенное высвобождение)
    4-6 часов (немедленное высвобождение)
    12 часов (расширенное высвобождение)
    IM / IV / SC 5-10 минут 3-6 часов
    трамадол Оральный 30-60 минут (немедленное высвобождение)
    1-2 часа (расширенное высвобождение)
    4-6 часов (немедленное высвобождение)
    24 часа (расширенное высвобождение)

    Безопасны ли наркотические анальгетики?

    Существуют серьезные риски, связанные с наркотическими анальгетиками, включая угнетение дыхания (необычно медленное и поверхностное дыхание), расстройство, вызванное употреблением опиоидов, и потенциально смертельную передозировку.

    Расстройство, связанное с употреблением опиоидов, определяется как повторяющееся возникновение по крайней мере двух из 11 конкретных проблем, связанных с опиоидами, включая употребление опиоидов в увеличенных количествах или в течение более длительного времени, чем предполагалось; продолжительное использование, несмотря на вмешательство в повседневную деятельность; или все еще использую в опасных ситуациях. Тяжелое расстройство, связанное с употреблением опиоидов, определяется как совокупность из 6 или более проблем, и оно может затрагивать людей любого образования и социально-экономического происхождения.

    Наркотические анальгетики потенциально вызывают привыкание, и риск эмоциональной и физической зависимости от них увеличивается, чем больше вы принимаете и чем дольше вы их принимаете.При назначении врачом и использовании в течение коротких периодов времени, например, менее пяти дней для снятия боли после операции, риск привыкания к наркотическим анальгетикам относительно низок.

    Число смертельных передозировок опиоидов продолжает расти, и это привело к тому, что правительственные чиновники приняли новое законодательство, чтобы еще больше ограничить назначение опиоидов. Более 42 000 человек умерли в 2016 году из-за передозировки опиоидов; 40% этих смертей были вызваны приемом рецептурных наркотических анальгетиков.

    Наркотические анальгетики считаются приемлемыми при приеме в точном соответствии с предписаниями врача, в течение коротких периодов времени для облегчения сильной боли и под строгим контролем. Тем не менее, несмотря на правильное использование, они могут быть связаны с некоторыми серьезными побочными эффектами.

    Каковы побочные эффекты наркотических анальгетиков?

    Наркотические анальгетики обладают множеством побочных эффектов, хотя люди с онкологическими или неизлечимыми заболеваниями, принимающие наркотики в течение длительных периодов времени, могут стать толерантными к некоторым из этих побочных эффектов.

    Сонливость, сонливость или головокружение характерны для большинства наркотических анальгетиков. Это может повлиять на вождение или способность человека управлять механизмами и выполнять другие опасные работы. Алкоголь может усилить эти эффекты.

    Другие часто сообщаемые побочные эффекты включают:

    Абстинентный синдром может возникнуть, когда люди, принимавшие наркотические анальгетики, резко прекращают их прием. Симптомы похожи на грипп и могут включать ломоту в теле, озноб, депрессию, диарею, мурашки по коже, головные боли, высокое кровяное давление, бессонницу, раздражительность, насморк и пот.Симптомы отмены обычно длятся около недели.

    Список литературы

    1. Опиоидная зависимость. Факты и цифры, 2016 г. Американское общество наркологической медицины. https://www.asam.org/docs/default-source/advocacy/opioid-adiction-disease-facts-figures.pdf
    2. Drewes AM, Jensen RD, Nielsen LM и др. Различия между опиоидами: фармакологические, экспериментальные, клинические и экономические перспективы. Британский журнал клинической фармакологии . 2013; 75 (1): 60-78.DOI: 10.1111 / j.1365-2125.2012.04317.x.
    3. Канадские рекомендации по безопасному и эффективному использованию опиоидов при хронической нераковой боли Майкл Г. ДеГрут. Национальный центр боли. Университет Макмастера. http://nationalpaincentre.mcmaster.ca/opioid_2010/cgop_b02_r08.html
    4. Фентанил Эффентора 100 мкг Буккальные таблетки. ЭМС. TevaPharmaBC https://www.medicines.org.uk/emc/product/5400/smpc#PHARMACOKINETIC_PROPS
    5. Рациональное использование опиоидов. Stanford Education 2008. http: //ether.stanford.edu / ca1 / text08 / i.pdf.
    6. http://www.pharmacytimes.com/publications/issue/2011/june2011/an-overview-of-opioids

    Всегда консультируйтесь со своим врачом, чтобы убедиться, что информация, отображаемая на этой странице, применима к вашим личным обстоятельствам.

    2020 BMW M5 Обзор, цены и характеристики

    Обзор

    Не называйте это возвращением. BMW M5 существует уже много лет. Однако последнее поколение потрясает своих сверстников и вселяет страх в сердца других спортивных седанов.Обладая мощностью более 600 лошадиных сил от своего твин-турбо V-8, M5 2020 года разгоняется с необузданной свирепостью. Его стандартная система полного привода может даже передавать всю эту мощность на задние колеса для водителей, которые любят свешивать хвост. Действительно, BMW заново изобрела икону, которая стала почти неузнаваемой. Хотя M5 по-прежнему остается большим роскошным седаном, оснащенным высокотехнологичными устройствами, теперь у него есть маниакальная сторона, которой в последнее время не хватало в легендарном подразделении M компании.

    Что нового в 2020 году?

    В 2020 году BMW вносит небольшие изменения в линейку M5, которые включают новое стандартное оборудование и выпуск M5 Edition 35 Years ограниченным тиражом.Каждая модель теперь поставляется с 12,3-дюймовым кластером цифровых датчиков, информацией о трафике в реальном времени, удаленными услугами и зарядкой беспроводных устройств. США получат только 35 экземпляров M5 Edition 35 Years с неуклюжим названием, которые основаны на модели Competition и включают в себя уникальную золотую внутреннюю отделку, а также эксклюзивную внешнюю окраску Frozen Dark Grey II.

    Цены и какой из них купить

    Тем, кто хочет получить максимальную 5-ю серию, следует выбрать M5 Competition, который, по нашему мнению, является лучшим M5.Этот выбор требует дополнительных 7300 долларов за дополнительные 17 лошадей, специально настроенные настройки подвески и некоторые уникальные элементы стиля. Обновления не ставят под угрозу ходовые качества или удобство жизни 5-го автомобиля. Мы бы добавили 20-дюймовые колеса (19 в стандартной комплектации) и пакет Executive. Последний предлагает такие предметы роскоши, как вентилируемые передние сиденья с функциями массажа, подогрев передних и задних сидений, двери с мягким закрыванием, четырехзонный автоматический климат-контроль, помощь при самостоятельной парковке и многое другое.

    Двигатель, трансмиссия и характеристики

    Спортивный твин-турбо 4.4-литровый восьмицилиндровый двигатель с мощностью 600 лошадиных сил и крутящим моментом 553 фунт-фут, M5 очень быстр. На нашем испытательном треке он разогнался до 60 миль в час за 2,8 секунды и разогнался до четверти мили за 10,9 секунды на скорости 129 миль в час; максимальная скорость ограничена губернатором 163 миль в час. Теперь доступна еще более мощная модель M5 Competition — 617 лошадиных сил. На нашем ежегодном Lightning Lap он оказался быстрее обычного M5 на настоящей гоночной трассе. Верные M5 будут сетовать на снятую с производства механическую коробку передач и незнакомую систему полного привода, но этот Bimmer имеет высокотехнологичную трансмиссию, которая может передавать 100 процентов мощности на задние колеса для чистого заднеприводного стиля.Удовольствие от вождения здесь повышается благодаря живому и прямому рулевому управлению, хорошо контролируемой (почти жесткой) езде и героическому сцеплению с дорогой. Это не означает, что M5 также не может выполнять обязанности роскошного седана: в режиме Comfort он спокойно путешествует, а в салоне тихо.

    Экономия топлива и реальная MPG

    По оценкам EPA, обычный M5 и его вариант Competition заработают 15 миль на галлон в городе и 21 милю на галлон на шоссе. Оба показателя хуже, чем у Porsche Panamera Turbo (18 миль на галлон по городу и 25 миль на шоссе) и аналогичны седану Mercedes-AMG E63 S (15 миль на галлон по городу и 25 миль на галлон по шоссе).Мы протестировали M5 Competition на нашем 200-мильном маршруте экономии топлива, где он превысил рейтинг правительства на 3, в результате чего шоссе на 24 мили на галлон.

    Интерьер, комфорт и груз

    M5 2020 имеет элегантный кожаный салон с мягкими и удобными спортивными сиденьями. Сиденье водителя оптимизировано для динамичного вождения, и BMW не пошла по пути использования сенсорных экранов, как у многих его конкурентов, поэтому внесение изменений в кондиционер или настройку радио во время вождения мало отвлекает.Также есть множество желаемых стандартных функций, которые включают настраиваемое внутреннее освещение, рулевое колесо с подогревом, передние сиденья с подогревом и рулевую колонку с регулировкой мощности. Дополнительные опции включают вентилируемые передние сиденья с функциями массажа, задние сиденья с подогревом и четырехзонный автоматический климат-контроль. В нашем тесте багажник M5 вмещал шесть чемоданов ручной клади.

    Информационно-развлекательная система и возможности подключения

    На большом информационно-развлекательном дисплее M5 работает новейшее программное обеспечение BMW iDrive, он расположен на приборной панели справа от поля зрения водителя и управляется поворотной ручкой на центральной консоли.Хотя функция Android Auto недоступна, интеграция Apple CarPlay и точка доступа Wi-Fi являются стандартными. Также есть аудиосистема Harman / Kardon с 16 динамиками, 600 Вт и беспроводная зарядка устройств на всех моделях 2020 года. Те, кто хочет еще более изысканных функций, могут выбрать дополнительную развлекательную систему для задних сидений и аудиосистему Bowers & Wilkins с 16 динамиками и мощностью 1400 Вт.

    Функции безопасности и помощи водителю

    M5 2020 года не проходил краш-тестов Национальным управлением безопасности дорожного движения (NHTSA) или Страховым институтом безопасности дорожного движения (IIHS).Спортивный седан предлагает широкий выбор стандартных и дополнительных технологий помощи водителю. Основные функции безопасности включают:

    • Стандартное предупреждение о лобовом столкновении и автоматическое экстренное торможение
    • Стандартное предупреждение о выезде с полосы движения и помощь в удержании полосы
    • Доступный адаптивный круиз-контроль с технологией Stop-and-Go

      Гарантия и обслуживание Гарантия

      BMW предоставляет ограниченную гарантию и защиту трансмиссии, которая соответствует требованиям конкурентов класса люкс.Его бесплатное плановое техническое обслуживание короче, чем у Jaguar, но план BMW по-прежнему считается одним из лучших.

      • Ограниченная гарантия распространяется на четыре года или 50000 миль
      • Гарантия на трансмиссию покрывает четыре года или 50000 миль
      • Бесплатное плановое обслуживание распространяется на три года или 36000 миль
        Технические характеристики

        Технические характеристики

        2019 BMW M5 Competition

        ТИП АВТОМОБИЛЯ

        передний двигатель, задний / полный привод, 5-местный, 4-дверный седан

        ЦЕНА ПО ТЕСТИРОВАНИЮ

        129 595 долларов США (базовая цена: 111 995 долларов США)

        ТИП ДВИГАТЕЛЯ

        32-клапанный V-8 с двойным турбонаддувом и промежуточным охлаждением DOHC, алюминиевый блок и головки, непосредственный впрыск топлива

        Рабочий объем

        268 куб. Дюймов, 4395 куб. См
        Мощность

        617 л.с. при 6000 об / мин
        Крутящий момент

        553 фунт-фут при 1800 об / мин

        ТРАНСМИССИЯ

        8-ступенчатый автомат с ручным режимом переключения

        ШАССИ

        Подвеска (передняя / задняя): многоканальная / многоканальная
        Тормоза (передний / задний ход): 15.Диск из углеродистой керамики, 8 дюймов, вентилируемый, перфорированный, перфорированный, перфорированный, 15 дюймов
        Шины: Pirelli P Zero PZ4 F: 275 / 35R-20 (102Y) ★ R: 285 / 35R-20 (104Y) ★

        РАЗМЕРЫ

        Колесная база: 117,4 дюйма
        Длина: 195,5 дюйма
        Ширина: 74,9 дюйма
        Высота: 57,8 дюйма
        Пассажировместимость: 102 куб.футов
        Объем багажника: 19 куб.футов
        Снаряженная масса: 4262 фунта

        C / D
        РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ

        От нуля до 60 миль в час: 2.8 секунд
        От нуля до 100 миль в час: 6,7 с
        От нуля до 130 миль / ч: 10,9 с
        От нуля до 150 миль / ч: 15,2 с
        Старт с места, 5–60 миль / ч: 3,5 с
        Высшая передача, 30–50 миль / ч: 2,1 с
        Высшая передача, 50–70 миль / ч: 2,4 секунды
        -Миля стоя: 10,9 сек @ 130 миль / ч
        Максимальная скорость (ограничена регулятором): 162 миль / ч
        Торможение, 70–0 миль / ч: 152 фута
        Сопротивление дороги, трелевочная площадка диаметром 300 футов: 1,00 г

        Время разгона с места без учета отката на 1 фут 0.2 сек.

        C / D
        ЭКОНОМИЯ ТОПЛИВА

        Наблюдаемое: 15 миль на галлон

        ЭКОНОМИКА ТОПЛИВА EPA

        Комбинированный / город / шоссе: 17/14/21 миль на галлон

        СКАЧАТЬ ИСПЫТАТЕЛЬНЫЙ ЛИСТ

        Дополнительные функции и характеристики

        Все мускариновые рецепторы ацетилхолина (M 1 -M 5) экспрессируются в эндотелии микрососудов головного мозга мыши.

        Все экспериментальные протоколы были одобрены этическим комитетом Университета Вероны.Методы были выполнены в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами.

        Культуры эндотелиальных клеток головного мозга

        Чтобы избежать систематических ошибок из-за загрязнения астроцитами и / или терминалами 18 , мы исследовали mAChR в первичных культурах эндотелиальных клеток, отделенных от ткани микрососудов головного мозга или в линии эндотелиальных клеток. Первичные эндотелиальные микрососудистые клетки мозга мыши Balb / c BMVECs (# PB-BALB-5023, PELOBiotech, Германия; пассажи 3–6) и клетки линии клеток мыши Balb / c bEnd.3 (# ATCC® CRL-2299 ™, ATCC, USA; пассажи 20-30) культивировали, как описано ранее 62 . Оба типа эндотелиальных клеток тестировались на контаминацию микоплазмой дважды в год с использованием протокола окрашивания ДНК Hoechst (# B2883, Sigma). Клетки высевали с плотностью 2 × 10 4 клеток / см 2 на 24-миллиметровые покровные стекла для протоколов визуализации внутриклеточного кальция и иммунофлуоресценции или во флаконы 25 см 2 и затем собирали для qRT-PCR и количественные анализы белка.

        Экспрессия гена с помощью qRT-PCR

        Для количественной оценки уровней экспрессии Chrm1-5 (M 1 -M 5 гены, кодирующие рецептор ) в эндотелиальных клетках микрососудов мозга мыши, общая РНК была извлечена с использованием GenElute Набор MiniPrep для общей РНК млекопитающих (RTN70, Sigma) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрации РНК определяли с помощью спектрофотометрических измерений поглощения при 260 и 280 нм (Beckman Coulter DU 730). Обработку ДНКазой I использовали для удаления загрязняющей геномной ДНК.В соответствии с рекомендациями производителя (Sigma) в наших экспериментах соотношение A 260 : A 280 составляло 2,03 ± 0,06 (bEnd.3) и 1,93 ± 0,03 (BMVEC). Обратную транскрипцию проводили с использованием набора High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, США). Actb и Gapdh использовались в качестве генов домашнего хозяйства. Следующие мышиные праймеры Taqman (Life Technologies, США) были использованы в соответствии с рекомендациями производителя: Chrm1 (Mm00432509_s1), Chrm2 (Mm01701855_s1), Chrm3 (Mm01338409_m1),

        4 Chrm2s4 (Mm01701883_s1), Gapdh (Mm999999_g1) и Actb (Mm00607939_s1).Дополнительная информация о выборе праймеров для Chrm1 и Chrm2 представлена ​​на дополнительном рисунке 1. Относительное количество транскриптов Chrm1-5 оценивалось с помощью qRT-PCR с использованием методологии TaqMan и системы обнаружения последовательностей ABI Prism 7300 ( Applied Biosystems, США). Реакции проводили трижды по 50 циклов.

        Оценка локализации мускариновых рецепторов с помощью иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии

        Клеточную локализацию рецепторов M 1 -M 5 оценивали с помощью иммунофлуоресценции.Эндотелиальные клетки головного мозга обрабатывали блокирующим и пермеабилизирующим раствором (0,3% Тритон 100, 1% бычий сывороточный альбумин, 2% нормальная козья сыворотка) в течение 30 минут и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре с первичным антителом. Затем их инкубировали в течение 1 ч со вторичным антителом, после чего инкубировали с TO-PRO ® -3 (1: 3000, Life Technologies) в течение 10 минут для окрашивания ядер и, наконец, помещали в флуоресцентную среду для закрепления. Использовали следующие поликлональные первичные кроличьи антитела от Alomone, Израиль: анти-M 1 (1: 100, # AMR-001), анти-M 2 (1: 100, # AMR-002), анти-M 3 (1: 100, # AMR-006), анти-M 4 (1: 100, # AMR-004) и анти-M 5 (1: 100, # AMR-005).Первичное антитело не использовали в образцах отрицательного контроля. Козье антитело против кролика Alexa 488 (1: 1000, Life Technologies) использовали в качестве вторичного антитела. Нормальная козья сыворотка и флуоресцентная среда для закрепления были приобретены в Dako, Милан, Италия.

        Образцы исследовали с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа (LSM 710, Carl Zeiss, Германия), оснащенного масляным объективом 63x. Были использованы следующие параметры сбора данных: точечное отверстие, соответствующее 1 единице Эйри для каждого лазера, 62 мкм для лазера 488 нм и 66 мкм для лазера 633 нм, цифровое усиление 1.00 и интенсивность 5% для каждого лазера. Настройки параметров сбора данных оставались фиксированными для каждого канала в разных сеансах получения изображений. Получение изображений осуществляли с помощью программного обеспечения Zeiss LSM Image Browser (Carl Zeiss, Германия). Визуальная оценка распределения интенсивности флуоресценции в ядре, цитоплазме и плазмалемме использовалась для характеристики клеточной локализации рецепторов. Интенсивность зеленого канала оценивалась следующим образом: — (не наблюдается), + (низкая), ++ (средняя) и +++ (высокая).Для каждого рецептора было забито 40 клеток. Из-за внутренних трудностей с четкой изоляцией мембранной маркировки мы рассматриваем эту оценку как строго качественную.

        Протокол экстракции белка

        Мы использовали метод иммуномагнитного сродства к белку для количественной оценки на основе масс-спектрометрии рецепторов M 1 -M 5 из образцов клеток BMVEC и bEnd.3. Клетки собирали в микропробирки и сразу же помещали на лед. Затем их гомогенизировали серией из 10 ультразвуковых импульсов (Sonopuls HD 2070, Bandelin, Германия) по 1 секунде каждый при 50% максимальной частоты в 10 мМ PBS (pH 7.4, Sigma) с добавлением коктейля из ингибиторов протеазы для использования с экстрактами клеток и тканей млекопитающих (# P8340, Sigma) в соответствии с инструкциями производителя. Затем гомогенаты центрифугировали при 1000 × g в течение 10 минут при 4 ° C для удаления клеточного мусора. Клеточные лизаты собирали, смешивали с загрузочным буфером Laemmli (# 161-0737, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) и нагревали при 70 ° C в течение 20 минут.

        Используя 4–15% белковые гели Criterion ™ TGX Stain-Free ™ (№ 567-8084, Bio-Rad), мы выделили 15 мкг лизата для каждого образца клеток.Затем профили общего белка в образцах визуализировали с использованием имидж-сканера Bio-Rad ChemiDoc MP в течение нескольких минут после завершения электрофореза для проверки образца белка и качества разделения (дополнительный рисунок 2A). После визуализации и получения изображения УФ-активацию полос проводили с помощью системы ChemiDoc MP. Гели были разделены на отдельные линии, каждая из которых содержала отдельные белки (от 10 до 250 кДа). Затем отдельные линии помещали во флаконы, содержащие 10 мл дистиллированной воды.Затем водный раствор и линии геля гомогенизировали и затем обрабатывали ультразвуком в ультразвуковой ванне (Sonorex, Германия) в течение 20 минут при 4 ° C. Затем образцы центрифугировали при 6500 g (комнатная температура) и собирали супернатанты, фильтрованные на 0,2 мм микрофильтре из ПТФЭ. Небольшой объем супернатанта использовали для определения общего количества белков методом Брэдфорда (дополнительный рис. 2В). Затем 1 мл супернатанта (т.е. 10% от общего количества) инкубировали с покрытыми антителами магнитными частицами, которые были приготовлены, как описано ниже.

        Мы связали неразбавленные антитела анти-M 1-5 (1 мкл, Alomone) с функционализированными магнитными частицами (Dynabeads® M-280, тозил-активированный суперпарамагнитный полистирол) для иммуноаффинного захвата. Стандарты белков для рецепторов M 1 -M 5 были предоставлены Alomone, Израиль и использовались в качестве калибровочных контролей в масс-спектрометрическом анализе с лазерной десорбционной ионизацией с использованием матрицы (MALDI-TOF).

        Иммуномагнитная изоляция с последующим анализом MALDI-TOF MS

        Мы следовали нашему ранее опубликованному протоколу 63 с антителами, подробно описанными ниже.Кандидаты в мускариновые рецепторы выделяли с использованием поликлональных аффинно очищенных антител, приобретенных в Alomone Labs (как описано выше). Матрица MALDI 1,2-диметокси-4-гидроксикоричная (синапиновая кислота) и другие химические вещества были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США), а химические растворители закуплены у Merck (Дармштадт, Германия).

        Во время процедуры изоляции использовались следующие буферы:

        • Буфер A: 0,1 М натрий-фосфатный буфер, pH 7.4

        • Буфер B: забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) pH 7,4 с 0,1% (мас. / Об.) Бычьим сывороточным альбумином (BSA)

        • Буфер C: 0,2 M Трис pH 8,5 с 0,1% (мас. / Об.) BSA;

        • Буфер D: 100 мМ глицин (pH 2,5)

        Dynabeads M-280, тозил-активированные суперпарамагнитные полистирольные шарики, покрытые полиуретаном, дважды промывали в буфере A для удаления азида натрия (NaN 3 ) с использованием концентратора магнитных частиц в соответствии с протоколом производителя (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США).Перечисленные выше антитела (по 1 мкл каждого) растворяли в 100 мкл буфера A и добавляли к 100 мкл суспензии Dynabeads, перемешивали в течение 1 мин с последующей 24-часовой инкубацией при 37 ° C при перемешивании. Затем супернатант удаляли, и частицы дважды промывали буфером B (500 мкл) при 4 ° C. Свободные тозильные группы на шариках блокировали буфером C (500 мкл; 4 ч, 37 ° C) с последующей промывкой буфером B (500 мкл; 5 мин, 4 ° C). Каждый отдельный препарат покрытых антителами магнитных шариков ресуспендировали в 1 мл супернатанта и инкубировали при встряхивании в течение 1 ч при 37 ° C.Затем супернатанты удаляли и шарики пять раз промывали буфером B (500 мкл; 4 ° C, 5 мин, встряхивание). Захваченные антигены элюировали буфером D (50 мкл; 4 ° C, 1 мин, встряхивание) и шарики разделяли магнитным способом. Элюаты обессоливали с помощью C18 ZipTip (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) перед анализом с помощью матричной лазерной десорбционной ионизации-времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS).

        Анализ MALDI-TOF MS

        Данные MALDI-TOF MS были получены на масс-спектрометре Autoflex (Bruker Daltonics, Германия) с мишенью для образца MALDI (600 мкм Chip ™; Bruker Daltonics).Ионизация была достигнута путем облучения азотным лазером (337 нм), работающим при 4 Гц. Ионы ускорялись при 20 кВ с задержкой импульсного извлечения ионов 250 нс. Свежеприготовленную 1,2-диметокси-4-гидроксикоричную кислоту использовали в качестве матрицы (10 мг / мл) в 50% ацетонитриле 0,1% (об. / Об.) Трифторуксусной кислоты. Параметры прибора и энергия лазера поддерживались постоянными во время серии экспериментов, проведенных в один и тот же день для сравнения значений интенсивности (имп / с).

        Сначала были получены МС-спектры стандартных рецепторных белков.Площади под интересующим пиком были использованы для построения калибровочных кривых, что позволит позже количественно определить рецепторы в наших образцах. Пик протонированного молекулярного иона (MH +) для каждого белка обнаруживался до уровня ниже пмоль с отношением сигнал / шум> 50. Этот предел обнаружения был сопоставим с иммунохимическими анализами.

        МС-спектры, полученные с нашими образцами, показали пики MH + при ожидаемых значениях m / z, совпадающие с наблюдаемыми для стандартных белков. Затем площади под пиком были нормализованы относительно площадей, интерполированных по калибровочным кривым.MALDI-TOF MS — это полуколичественный метод; однако при использовании тщательной подготовки образцов и метода сбора данных интенсивность пика (ов) MH + линейно возрастала с увеличением количества каждого белка от наномолярного до пикомолярного диапазонов. Следовательно, в этом диапазоне концентраций оценки белковых биомаркеров можно рассматривать как количественные 63 .

        Измерения изображения внутриклеточного кальция

        Эксперименты по визуализации Ca 2+ на основе Fura-2 AM проводили на эндотелиальных клетках микрососудов головного мозга, как описано ранее 62 .Измерения проводили с помощью охлаждаемой CCD-камеры (Clara, Andor, Северная Ирландия) и монохроматора Polychrome V (Till Photonics, Германия), соединенного с вертикальным флуоресцентным микроскопом SliceScope (Scientifica, Великобритания) с водно-иммерсионным объективом 40x (Olympus, Япония ). Сбор данных выполняли с использованием программного обеспечения для визуализации Live Acquisition (Till Photonics, Германия), и изменения кальция определяли на основе отношения интенсивностей (R = I 340 нм / I 380 нм ). Соотношения рассчитывались для каждой клетки в поле зрения микроскопа и основывались на индивидуально определенных областях интереса после вычитания фона.Данные визуализации кальция были проанализированы с использованием программного обеспечения Offline Analysis (Till Photonics, Германия) и представлены как средняя амплитуда отношения флуоресценции (ΔR = R — R 0 , где R 0 представляет собой сигналы кальция, зарегистрированные в нестимулированных клетках) ± SEM .

        Растворы доставляли к эндотелиальным клеткам головного мозга через кварцевую перфузионную головку 100 мкм с использованием 8-канальной клапанной системы под давлением (ALA Scientific Instruments, США). Раствор Рингера содержал (в мМ) 140 NaCl, 5.6 KCl, 2 MgCl 2 , 2 CaCl 2 , 10 глюкозы, 10 HEPES (pH 7,4, доведенный до NaOH). Ацетоксиметиловый эфир Fura-2 (Fura-2 AM) и плюроновая кислота были приобретены у Life Technologies, США, и все обычные соли были у Sigma-Aldrich, Милан, Италия. Цитозольные переходные процессы Ca 2+ , возникающие в результате активации мускариновых рецепторов ацетилхолина, вызывались 20-секундным импульсом 1 мкМ хлорида ацетилхолина (ACh, Sigma). Воспроизводимость эффекта ACh проверяли по протоколу двойных импульсов с 10-минутным периодом вымывания по Рингеру между импульсами.В некоторых экспериментах мы заменили первый импульс ACh импульсом либо (±) -мускаринхлорида гидрата (# M104, Sigma), либо (-) — гидротартратной соли никотина (# SML1236, Sigma) в ранее описанных концентрациях (100 мкМ и 300 мкМ соответственно) 51, 63 , за которым следует второй импульс (1 мкМ ACh) после 10-минутного периода восстановления. Кривые «доза-ответ» для антагонистов mAChR получали, предшествуя второму импульсу ACh с 2-минутным нанесением антагониста. Были использованы следующие антагонисты: фумарат J104129 (антагонист M 3 , Tocris Bioscience, США), VU 0255035 (селективный антагонист M 1 , Tocris Biosciences), 4-DAMP (1,1-диметил-4-дифенилацетилпиперидиний йод ; Антагонист M 3 , Sigma) и гидрат дигидрохлорида телензепина (антагонист M 1 , Sigma).Мы также протестировали действие AC-42 (# SML0787, Sigma), селективного аллостерического агониста M 1 , с EC 50 = 29 нМ (на основе анализа выбора рецепторов и амплификации) для M 1 и без влияния на M 2 -M 5 56 . AC-42 применяли в максимальной концентрации активации, исходя из ранее определенного значения EC 50 0,2 мкМ, оцененного с помощью анализа мобилизации кальция 39 . Кроме того, мы проверили действие мускаринового токсина МТ-7 (Smartox Biotechnology, Франция) при его концентрации насыщения, как описано ранее 55 , учитывая его высокое сродство к рецептору M 1 , т.е.е. k i = 0,2 нМ для M 1 и k i > 2000 нМ для M 2 -M 5 55 .

        Гомологическое моделирование и молекулярный докинг

        Эукариотические последовательности были загружены из базы данных Pfam (10.1093 / nar / gkv1344), а сохранность остатков рассчитывалась как процент (X / P) * 100, где X — остаток и P — длина множественного выравнивания последовательностей. Поскольку мыши M 1 -M 5 не имеют структурной информации, гомологическое моделирование было выполнено для прогнозирования их трехмерных структур.Последовательности были получены из базы данных Uniprot, а модели были созданы через веб-сервер GOMoDo 64 . Чтобы обеспечить сохранение консервативных структурных отпечатков GPCR класса A (родопсин-подобных) 65 , все выравнивания последовательностей между мишенями и матрицами (подробно проиллюстрированные в дополнительной таблице 2) проверяли вручную. Трехмерные структуры, полученные на этапе моделирования гомологии, были использованы для выполнения виртуальных исследований стыковки с помощью программы стыковки HADDOCK 66 через веб-сервер GOMoDo.Мы использовали общую позицию номера GPCRdb 67 , которая обобщает классическую нумерацию Баллестероса-Вайнштейна. Остатки в положениях 3.32, 3.33, 3.36, 3.37, 4.57, 5.39, 5.42, 6.48, 6.51, 7.39 и 7.43 считались «активными остатками», чтобы направлять стыковку. Эти остатки уже были охарактеризованы как участвующие в связывании агонистов / антагонистов 33, 43 . Структуры четырех антагонистов были загружены из базы данных ZINC 68 и параметризованы с помощью ACPYPE 69 .Протокол стыковки включал три этапа: (а) минимизация энергии твердого тела, (б) полугибкое уточнение в пространстве торсионных углов и (в) окончательное уточнение в явном растворителе. Мы выбрали 1000 структур для первого шага и 200 структур для второго и третьего шагов стыковки, используя параметры по умолчанию. Для каждой стыковки мы выбрали лучшую структуру, соответствующую наиболее населенному кластеру с наименьшим значением энергии. Рисунки были созданы с помощью Chimera 70 .

        Анализ данных

        Количественные данные ОТ-ПЦР были получены путем нормализации уровней мРНК Chrm1 Chrm5 к уровням мРНК Gapdh и Actb с использованием метода 2 (-Delta C (T)), как описано ранее. 71 . Результаты были выражены как log 10 -кратных изменений из-за их расширенного масштабного распределения и нанесены на график как среднее ± стандартное отклонение.

        Формализм Хилла 37 использовался для подгонки как концентрации ACh-ответ, так и кривых ингибирования, определенных с помощью записей изображений кальция с BMVEC и bEnd.{{\ rm {\ alpha}}}) $$

        (1)

        C соответствует концентрации агониста, ΔR max — отношение амплитуд максимального ответа на 10 мкМ ACh, EC 50 — концентрация агониста, необходимая для вызова полумаксимального ответа, а α — коэффициент Хилла, описывающий кооперативность и занятость рецептора mAChR 37 . Кривые ингибирования, полученные в результате анализа данных визуализации кальция, были подогнаны к следующему уравнению:

        $$ {\ rm {\ Delta}} {\ rm {R}} / {{\ rm {\ Delta}} {\ rm {R }}} _ {{\ rm {\ max}}} = \, 1 + \, ({\ rm {X}} — 1) {{\ rm {C}}} ^ {{\ rm {\ alpha} }} / ({{\ rm {C}}} ^ {{\ rm {\ alpha}}} + {{\ rm {IC}}} _ {50} ^ {{\ rm {\ alpha}}}) $$

        (2)

        IC 50 — концентрация антагониста, необходимая для снижения ответа агониста на 50%, C — концентрация агониста (1 мкМ), α — коэффициент Хилла.В уравнениях (1) и (2) значение коэффициента Хилла, равное 1, указывает, что только одна молекула агониста / антагониста активирует / ингибирует один рецептор). X = 0 для телензепина, фумарата J104129 и 4-DAMP, а X = подгоночный параметр для VU 0255035.

        Кажущаяся константа диссоциации была рассчитана с использованием уравнения Ченга – Прусова следующим образом:

        $$ {\ rm { K}}} _ {{\ rm {a}}} = {{\ rm {IC}}} _ {50} / (1 + {\ rm {C}} / {{\ rm {EC}}} _ {50}) $$

        (3)

        Обилие белка определяли в анализе MALDI / TOF MS, как описано ранее 72 .Вкратце, площадь под кривой наиболее распространенной полосы массы (пика) для каждого стандарта или образца белка рассчитывалась в серии из десяти повторов, и вычисленное среднее значение использовалось для определения концентрации каждого белка мускаринового рецептора. Идентификация полосы масс (пика) и количественное определение каждого белка мускаринового рецептора в наших образцах определяли по отношению к стандартному пику белка. Затем содержание белка для каждого мускаринового рецептора было нормализовано к общему количеству белков в образце.

        Статистический анализ, сравнивающий экспрессию 5 подтипов рецепторов, проводили следующим образом. Различия в экспрессии мРНК на основе данных ОТ-ПЦР анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (согласно Юаню и его коллегам, 73 ) с последующим проведением апостериорных тестов Бонферрони. Количественное определение белка на основе данных MALDI-TOF анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Holm-Sidak 2. Анализ и построение данных выполняли с помощью OriginPro 8 (OriginLab Corporation, США) и GraphPad Prism версии 7.00 (программное обеспечение GraphPad, Ла-Хойя, Калифорния, США).

        Доступность данных

        Авторы заявляют, что все данные, подтверждающие выводы этого исследования, доступны в статье и файлах с дополнительной информацией или у соответствующего автора по обоснованному запросу. Авторы предоставляют разрешение Nature Publishing Group, подразделению Macmillan Publishers Ltd, на публикацию всех изображений, содержащихся в рукописи, по лицензии открытого доступа.

        Кристаллическая структура мускаринового ацетилхолинового рецептора M5

        Значение

        5 подтипов мускариновых рецепторов ацетилхолина (mAChR) экспрессируются в центральной и периферической нервной системе, где они играют жизненно важную роль в физиологии и патологиях.В последнее время подтип mAChR M 5 стал интересной лекарственной мишенью для лечения наркозависимости. Мы определили атомную структуру mAChR M 5 , связанного с клинически используемым обратным агонистом тиотропием. Структура mAChR M 5 теперь позволяет провести полное сравнение всех 5 подтипов mAChR и показывает, что небольшие различия во внеклеточных областях петли могут опосредовать селективность ортостерических и аллостерических лигандов. Вместе эти открытия открывают дверь для будущего дизайна на основе структуры селективных лекарств, нацеленных на этот терапевтически важный класс рецепторов.

        Abstract

        Человеческий рецептор M 5 мускаринового ацетилхолина (mAChR) недавно стал интересной терапевтической мишенью для лечения ряда заболеваний, включая наркоманию. Однако отсутствие структурной информации для этого подтипа рецепторов ограничивает дальнейшую разработку и валидацию лекарств. Здесь мы сообщаем о кристаллической структуре высокого разрешения mAChR человека M 5 , связанного с клинически используемым обратным агонистом, тиотропием. Эта структура позволила провести сравнение всех 5 членов семейства mAChR, которое выявило важные различия как в ортостерических, так и в аллостерических сайтах, которые могут служить основой для рационального дизайна селективных лигандов.Эти структурные исследования вместе с химерными перестановками между внеклеточными областями mAChR M 2 и M 5 предоставили структурное понимание кинетической селективности, где лиганды показывают разное время пребывания между родственными членами семьи. В совокупности наше исследование обеспечивает важную информацию о природе взаимодействия ортостерических и аллостерических лигандов в семействе mAChR, которые могут быть использованы для разработки селективных лекарств.

        Мускариновые рецепторы ацетилхолина (ACh) (mAChR) представляют собой рецепторы класса A G, связанные с белками (GPCR), которые вместе с никотиновыми рецепторами ацетилхолина облегчают действие нейротрансмиттера ACh во всем организме.Семейство mAChR включает 5 подтипов, в которых M 1 , M 3 и M 5 предпочтительно связаны с сигнальными путями, опосредованными белком G q / 11 , и M 2 и M 4 демонстрируют предпочтение G i / o белково-зависимой передачи сигналов. Исследования локализации показали, что подтипы mAChR распределены по-разному, с M 1 , M 4 и M 5 mAChR, обнаруженных преимущественно в центральной нервной системе (ЦНС), где они необходимы для нормальной функции нейронов, тогда как M 2 и M 3 mAChR экспрессируются более широко, в том числе на периферии, где они участвуют в сердечно-сосудистой системе, а также в моторике кишечника и секреторных процессах (1).

        Учитывая участие mAChR в таком широком спектре фундаментальных физиологических процессов, они долгое время ценились как мишени для новых терапевтических средств, в частности центральных mAChR M 1 и M 4 , которые привлекли внимание из-за их участие в познании и памяти (2). Напротив, о подтипе mAChR M 5 известно относительно меньше, что составляет менее 2% от общей популяции mAChR в ЦНС (3, 4). Несмотря на низкий уровень экспрессии, этот рецептор играет жизненно важную роль в мезолимбическом пути вознаграждения из-за его присутствия на дофаминергических нейронах вентральной тегментальной области (5-8).Кроме того, существует большая популяция ненейрональных mAChR M 5 , расположенных в эндотелии сосудов головного мозга, что позволяет предположить, что рецептор может модулировать церебральные вазодилататорные процессы (9, 10). Эти наблюдения хорошо коррелируют с фенотипическими данными мышей с нокаутом M 5 mAChR, у которых церебральная сосудистая сеть постоянно сужена, что приводит к снижению церебрального кровотока (11, 12). Кроме того, мыши с нокаутом M 5 mAChR демонстрировали ослабленное стремление к вознаграждению в отношении наркотиков, вызывающих зависимость, таких как кокаин и морфин, в экспериментах с самостоятельным введением и условным предпочтением места (13–15).Более того, в недавних исследованиях с участием крыс (16–18) стремление к этанолу и самовведение оксикодона ослаблялись селективным M 5 mAChR отрицательным аллостерическим модулятором (NAM) ML375 (19). По результатам этих исследований mAChR M 5 стал потенциальной мишенью для лечения наркозависимости.

        Несмотря на такие многообещающие данные, дальнейшее изучение mAChR M 5 было затруднено из-за отсутствия селективных низкомолекулярных инструментальных соединений. Создание обычных низкомолекулярных лигандов, нацеленных на ортостерический ACh-связывающий сайт отдельных подтипов mAChR, было сложной задачей из-за высококонсервативной гомологии последовательностей остатков ортостерических сайтов mAChR (1) и отчасти из-за отсутствия подробной структурной информации для всех 5 подтипов рецепторов.Хотя структуры mAChR с M 1 по M 4 были ранее определены, доступных структур для mAChR с M 5 нет. Таким образом, чтобы обеспечить полное структурное сравнение всех 5 членов семейства, мы определили кристаллическую структуру с высоким разрешением mAChR M 5 , которая выявила различия в областях внеклеточной петли (ECL), которые могут опосредовать селективность ортостерических и аллостерических лигандов. Основываясь на этих различиях и на том факте, что в настоящее время известно, что некоторые лекарства имеют разные скорости связывания между подтипами mAChR, что может привести к клинически значимой «кинетической» селективности, мы также сделали химерные замены областей ECL между M 2 и M . 5 mAChR для исследования роли этих областей в обеспечении этого важного режима селективности лекарственного средства.

        Результаты

        Кристаллизация и определение структуры мАХР M

        5 .

        Для определения структуры mAChR M 5 мы разработали конструкцию, в которой остатки от 225 до 430 внутриклеточной петли 3 были удалены и заменены гибридным белком лизоцима Т4 (T4L). Кроме того, для ускорения кристаллизации первые 20 N-концевых аминокислот были расщеплены сайтом протеазы вируса травления табака, сконструированным в рецепторе ( SI Приложение , рис.S1). Обратный агонист, тиотропий, использовался для стабилизации неактивного состояния, поскольку он имеет медленную скорость диссоциации mAChR M 5 (20), а также использовался при определении M 1 , M 3 и M 4 структур мАХР (21, 22). Комплекс M 5 -T4L • тиотропий кристаллизовался в липидной кубической фазе (LCP), и кристаллы получали в течение 1-2 дней; однако, несмотря на множество раундов оптимизации, дифракция была ограничена 7 Å. Чтобы улучшить разрешение, мы основывались на исследовании Kajiwara et al.(23), который предсказал, что мутация аминокислоты в положении 3.39 [пронумерованная согласно Ballesteros-Weinstein (24)] на Arg создаст термостабилизированный рецептор, способствуя ионной связи между этим остатком и высококонсервативным остатком D 2,50 . Недавно та же самая мутация S 3.39 R была применена к mAChR M 2 , что привело к созданию серии структур с более высоким разрешением (25). Хотя введение мутации S117 3,39 R привело к созданию конструкции, которая связывает антагонисты N-метилскополамина (NMS) или тиотропия со слегка пониженной аффинностью по сравнению с mAChR дикого типа (WT) M 5 , эффект мутация по снижению сродства ACh была значительно более выраженной ( SI Приложение , рис.S1), что согласуется со способностью конструкции отдавать предпочтение неактивному состоянию, а не активному. Подобные дифференциальные эффекты на аффинность антагониста по сравнению с агонистом ранее наблюдались для S 3,39 R на M 2 mAChR (25). Примечательно, что введение мутации S117 3,39 R увеличивало выходы mAChR M 5 во время очистки и приводило к кристаллам, которые дифрагировали с разрешением 3,4 Å. Данные были собраны для ~ 130 кристаллов, и структура была определена путем молекулярного замещения с использованием структуры M 3 [банк данных белка (PDB) ID 4U15] и ансамбля структур T4L в качестве шаблонов (рис.1 A и SI Приложение , Таблица S1).

        Рис. 1.

        Структуры M 5 -T4L, связанного с тиотропием. ( A ) Наложение 5 различных M 5 структур mAChR, определенных в присутствии тиотропия и ( B ) различных аллостерических модуляторов. Структура из 4B-C 7 /3-phth была наиболее разрешенной из всех наборов данных и используется во всех дальнейших сравнениях.

        Чтобы исследовать природу связывания NAM с mAChR M 5 , мы попытались получить сокристаллические структуры.Учитывая, что лиганды бис-аммонийного алканового типа имеют тенденцию иметь более высокое сродство к mAChR M 5 , чем прототипный модулятор, галламин (26), мы попытались получить тройную комплексную структуру mAChR M 5 с тиотропием и несколько бисаммонийных алкановых лигандов (рис. 1 B ). Первоначально мы использовали модулятор 4B-C 7 /3-phth, в результате чего кристаллы выросли до гораздо большего размера и дифрагировали с разрешением 2,55 Å (Рис.1 и SI Приложение , Таблица S2 и Рис.S2). Основываясь на предыдущих данных (27), мы предсказали, что 4B-C 7 /3-phth будет связываться во внеклеточном преддверии (ECV). В то время как в ECV присутствовали области с высокой электронной плотностью, мы не могли однозначно смоделировать 4B-C 7 /3-phth в плотности, поскольку молекула осадителя, полиэтиленгликоля 400 (PEG400), также, вероятно, связывается в этом site (22, 28) и может объяснить, почему исследователи столкнулись с трудностями в получении co-NAM-связанных структур для mAChRs.

        Впоследствии мы разработали 2 аналога бисаммонийных алканов с использованием более высокого сродства 4P-C 7 /3-phth каркаса (27), чтобы попытаться улучшить сродство модулятора (рис.1 B ) и обнаруживаемость с помощью рентгеновских лучей. Первая модификация добавляла 2 атома брома (Br) (4P-C 7 /3-bromo-phth) для увеличения размера фталамидных групп (29), а вторая модификация укрепляла гибкий 7-углеродный линкер с ароматическим углеводород (4P-арил-C 7 /3-бром-фт). При тестировании в функциональных анализах инозитолфосфата (IP 1 ) и конкурентного связывания радиолиганда [ 3 H] NMS оба лиганда имели схожее сродство по отношению к исходному соединению (4P-C 7 /3-phth) ( SI Приложение , рис.S3 A и S4 и Таблица S3). Подобно 4B-C 7 /3-phth, добавление либо 4P-C 7 /3-бром-phth, либо 4P-арил-C 7 /3-бром-phth к очищенному M 5 mAChR и восстановление в LCP давало кристаллы, которые дифрагировали с более высоким разрешением ( SI Приложение , Таблица S1). Полный набор данных для 4P-арил-C 7 /3-bromo-phth был собран на длине волны 0,92 Å, чтобы максимизировать аномальный сигнал Br в эксперименте по аномальной дифракции на одной длине волны; однако такой сигнал не был обнаружен, что позволяет предположить, что 4P-арил-C 7 /3-бромфтанат не присутствует в структуре.Поскольку структура была решена путем слияния большого количества наборов данных, существует вероятность того, что сигнал Br для NAM будет усреднен, если занятость NAM низкая. Однако проверка различных наборов данных не показала, что это так.

        В качестве альтернативной стратегии мы попытались определить сокристаллическую структуру со структурно разнообразным M 5 mAChR-селективным NAM, ML375 (19). По сравнению с бис-аммониевыми лигандами добавление ML375 привело к немного более низкому разрешению структуры (2.7 Å, SI, приложение , таблица S1), и, как и в случае с бисаммониевыми NAM, мы не смогли приписать ML375 какую-либо электронную плотность. Сравнение всех структур mAChR M 5 показало, что они почти идентичны, со значениями среднеквадратичного отклонения от 0,09 до 0,22 Å. Для дальнейшего сравнения использовалась структура с более высоким разрешением 2,55 Å M 5 • тиотропий (4B-C 7 /3-phth), так как это была наиболее разрешенная и смоделированная структура ( SI Приложение , рис.S5).

        Сравнение всех подтипов mAChR в масштабе всей семьи.

        Решение структуры mAChR M 5 позволяет провести полное сравнение этого важного семейства GPCR по всем подтипам. Структура mAChR M 5 аналогична ранее определенным структурам подтипов mAChR от M 1 до M 4 (21, 22, 30) со среднеквадратичным отклонением от 0,5 до 0,8 Å (рис. 2 A ) для 7-трансмембранного домена для всех подтипов.5 подтипов mAChR наиболее похожи в ортостерическом сайте связывания, который является наиболее консервативной областью рецептора. Тот факт, что наша структура mAChR M 5 была получена в комплексе с тем же лигандом (тиотропием), что и структуры mAChR M 1 , M 3 и M 4 , позволил провести конкретное детальное сравнение выстилки остатков. этот ортостерический сайт связывания (фиг. 2 B и C ). Это сравнение продемонстрировало, что остатки в ортостерическом кармане абсолютно сохраняются между рецепторами.Хотя не существует связанной с тиотропием структуры mAChR M 2 , в настоящее время существует 6 различных структур mAChR M 2 в неактивном состоянии, которые включают структуры, связанные с неселективными лигандами 3-хинуклидинилбензилатом (QNB) и NMS и M 2. селективный лиганд mAChR AF-DX384 (25). Структура 2,3-Å M 2 • NMS наиболее сходна со структурами mAChR, связанными с тиотропием, хотя остатки Y 3,33 и Y 7,39 «тирозиновой крышки» (Y 3.33 , Y 6,51 и Y 7,39 ) расположены в отдельной конформации по сравнению со структурами, связанными с тиотропием. Эти различия в положениях тирозина на крышке более выражены в структурах M 2 • AF-DX384, что позволяет разместить этот более объемный лиганд в ортостерическом связывающем кармане (рис. 2 B и C ).

        Рис. 2.

        Структурное сравнение мАЧР М 1 и М 5 мАЧР. ( A ) Общий вид структур mAChR M 1 — M 5 , выровненных с mAChR M 5 и показанных в виде мультфильмов.M 1 • тиотропий персикового цвета (код PDB 5CXV), M 2 • NMS темно-синий (код PDB 5ZKC), M 2 • AF-DX384 желтый (PDB ID 5ZKB), M 3 • тиотропий голубой (PDB ID 4U15), M 4 • тиотропий розовый (PDB ID 5DSG) и M 5 • тиотропий зеленый (PDB ID 6OL9). ( B ) Сравнение остатков (представление стержня), выстилающих ортостерический сайт с тиотропием из M 5 mAChR, отображаемого и ( C ) наложения ортостерических лигандов.( D ) Вид с внеклеточной поверхности, сравнивающий различия в областях ECL между M 1 и M 5 mAChR. Расстояния между основной цепью M 1 и M 5 остатков mAChR в ECL2 и ECL3 показаны и указаны стрелками. ( E ) Электростатический и поверхностный потенциал M 2 и M 5 mAChR (+ 5kT / e в синем и -5kT / e в красном), нанесенный на поверхность рецепторов, рассчитанный при pH 7,0. ( F ) Сравнение скорости диссоциации и периода полураспада ( G ) [ 3 H] NMS путем добавления 10 мкМ атропина к мАХР M 2 и M 5 мАХР.Значения значительно различаются (значение P <0,0001, 2-сторонний дисперсионный анализ). Подробный статистический анализ приведен в Приложении SI , Таблица S5.

        Тонкие, но заметные различия между подтипами mAChR наблюдаются для ECL2 и ECL3, соответствующих областям, которые наименее консервативны по рецепторам (рис. 2 D ). В ECL2 существует разница в 1,8 Å для всех 5 подтипов, начиная с первого неконсервативного остатка ECL2. По мере продвижения ECL2 к TM5 консервативный мотив спирали 3 10 перемещается внутрь на 2.8 Å в мАХР M 5 по сравнению со структурой M 1 . Точно так же консервативная дисульфидная связь ECL3 смещена внутрь на 3,1 Å для mAChR M 3 и M 5 (фиг. 2 D ) относительно других подтипов. Эти наблюдаемые различия в положениях ECL2 и ECL3, наряду с различиями в аминокислотном составе, способствуют более ограниченному входу в сайт ортостерического связывания в M 5 (и M 3 ) по сравнению с M 2 mAChR (Рисунок.2 E ). Кроме того, это сокращение входа в связанные с антагонистом структуры может способствовать более медленной скорости диссоциации ортостерических лигандов из mAChR M 5 и M 3 по сравнению с другими подтипами, такими как mAChR M 2 . Например, несмотря на сходную аффинность равновесного связывания, [ 3 H] NMS диссоциирует в 18 раз медленнее в M 5 , чем в M 2 mAChR с периодом полураспада диссоциации 100 ± 11.6 и 5,7 ± 1,2 мин соответственно (рис.2 F и G ).

        Структурные различия между ECV M

        2 и M 5 mAChR.

        Альтернативной стратегией создания селективных лигандов является нацеливание на неконсервативные аллостерические сайты (31). Это было широко исследовано для семейства mAChR, в котором была идентифицирована палитра как положительных, так и отрицательных аллостерических модуляторов (32, 33). Структурные исследования и исследования мутагенеза установили, что многие из этих лигандов связываются с «общим» аллостерическим сайтом, который расположен над ортостерическим сайтом и внутри ECV (рис.3 и SI Приложение , рис. S6) (34). Фактически, mAChR M 5 часто служил модельной системой для ранних исследований в целях понимания способа связывания и механизма селективности для прототипных модуляторов, таких как лиганды бисаммонийалканов (рис. 1 B ), которые имеют более высокую чувствительность для модуляции mAChR M 2 и более низкую чувствительность для mAChR M 5 (26, 35⇓⇓ – 38). Эти исследования идентифицировали неконсервативные остатки в ECL2 (P179 -4 , E182 -1 и Q184 +1 ; верхний индекс указывает положение остатков ECL2 относительно консервативного Cys в ECL2) и TM7 (V474 7.32 и h584 7,36 ) в качестве остатков, которые могут составлять M 2 / M 5 селективность подтипа. Сравнение ECV между mAChR M 2 и M 5 подтверждает различия в ориентации и положениях этих остатков, которые могут опосредовать селективность. А именно, P179 −4 в ECL2 ограничивает положение E182 −1 , заставляя остаток в ECV около Q184 +1 . Остаток Q184 +1 , который является остатком F / Y для подтипов mAChR от M 1 до M 4 , является ключевым остатком для активности многих аллостерических модуляторов.Другие основные различия между ECV M 2 / M 5 заключаются в положениях неконсервативных остатков, выстилающих верхнюю часть TM6, начиная с S465 6,58 через ECL3 и до остатка h578 7,36 в TM7. В mAChR M 5 эти остатки более объемны и направлены внутрь, сужая общий размер ECV (рис. 3).

        Рис. 3.

        Сравнение остатков, выстилающих внеклеточный вестибюль M 2 и M 5 mAChR.M 2 • NMS показан темно-синим цветом, а M 5 • тиотропий — зеленым. Консервативные остатки помечены черным цветом, а неконсервативные остатки имеют цветные метки в зависимости от подтипа рецептора. Остатки пронумерованы на основе mAChR M 5 , причем остатки в ECL2 пронумерованы относительно консервативного цистеина в ECL2, который показан желтой сферой. Боковые цепи для D469 6,62 и K470 ECL3 усечены до β-углерода в отложенной модели из-за отсутствия плотности боковых цепей и моделируются здесь как наиболее вероятный ротамер.

        Роль областей M

        5 и M 2 mAChR ECL в связывании ортостерических и аллостерических лигандов.

        Влияние областей ECL на доступ и выход ортостерических лигандов имеет важное биологическое и клиническое значение (39). Поэтому, чтобы исследовать роль ECL в модуляции более медленной кинетики диссоциации mAChR M 5 по сравнению с mAChR M 2 , мы разработали полные химерные замены ECL1, ECL2 и / или ECL3 между двумя подтипами ( Инжир.4 и SI Приложение , рис. S7). Химеры ECL имели сходные уровни экспрессии и связывания [ 3 H] NMS с рецепторами WT ( SI, приложение , таблица S4). Как отмечалось ранее, mAChR M 2 имеет более короткий период полураспада для диссоциации [ 3 H] NMS по сравнению с mAChR M 5 (фиг. 2 F ). Включение M 2 ECL1 или ECL3 в M 5 mAChR увеличивало [ 3 H] диссоциацию NMS, тогда как обратный химерный обмен уменьшал диссоциацию [ 3 H] NMS в M 2 mAChR.Неожиданно именно обмены ECL1 оказали наибольшее влияние на диссоциацию [ 3 H] NMS между двумя подтипами, особенно на M 5 mAChR (Рис. 4 и SI Приложение , Таблица S5). Возможное структурное объяснение этого наблюдения может заключаться в том, что R95 ECL1 , который представляет собой консервативный остаток Tyr в подтипах M 1 — M 4 , способен образовывать ионную связь либо с остатком M 5 ECL2. D181 −2 или, в случае химеры M 2 ECL1, остаток D173 −3 (рис.3 и SI Приложение , рис. S6). Такое взаимодействие может связывать ECL1 и ECL2, ограничивая их общую динамику и тем самым снижая скорость диссоциации ортостерических лигандов. Важно отметить, что R95 ECL1 участвует в ионном взаимодействии через кристаллическую решетку с соседней молекулой T4L ( SI Приложение , рис. S2 D F ), и в результате не взаимодействуют напрямую с D181 -2 в структуре mAChR M 5 , хотя он имеет хорошие возможности для этого.

        Фиг. 4. Исследование кинетики диссоциации связывания

        [ 3 H] NMS химерных обменов между ECL M 2 и M 5 mAChR. ( A ) Рисунки для химер M 2 и M 5 ECL, использованных в этом исследовании. ( B ) [ 3 H] Реассоциацию NMS предотвращали добавлением 10 мкМ атропина, а диссоциацию радиолиганда контролировали в отсутствие (наполнитель) или в присутствии 10 мкМ ML375 или 10 мкМ 4P-C 7 / 3-пф.Точки данных представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего 3 или более независимых экспериментов, выполненных в двух экземплярах. ( C ) Сравнение периодов полураспада [ 3 H] NMS, показывающее как индивидуальные значения, так и среднее значение ± SEM (логарифмическая шкала). Полные количественные параметры, полученные в результате этого эксперимента, перечислены в приложении SI, приложение , таблица S5, включая статистический анализ.

        Отличительной чертой аллостерического лиганда, которая модулирует сродство ортостерического лиганда, является способность увеличивать или уменьшать скорость диссоциации ортостерического лиганда.Чтобы изучить влияние аллостерических модуляторов на диссоциацию NMS через химеры M 5 и M 2 ECL, мы использовали бис-аммонийный алкановый лиганд 4P-C 7 /3-phth, который ранее был изучен в M 2 mAChR и имел высокое сродство к M 5 mAChR ( SI Приложение , таблица S3) или селективному модулятору M 5 ML375 (19, 27). В присутствии ML375 диссоциация [ 3 H] NMS снижалась на M 5 mAChR и не оказывала влияния на M 2 mAChR, тогда как добавление 4P-C 7 /3-phth уменьшало диссоциация радиолиганда на mAChR M 2 , но не на mAChR M 5 (рис.4 и SI Приложение , Таблица S5). Химерные замены ECL1 и ECL3 мало влияли на активность ML375 для любого подтипа рецептора и немного повышали активность 4P-C 7 /3-phth на M 5 mAChR. Для химер ECL2 не было эффекта на активность ML375. Однако была потеря активности 4P-C 7 /3-phth mAChR M 2 и соответствующее увеличение активности mAChR M 5 . Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями и подчеркивают важность остатков в ECL2, особенно M 2 -Y177 и M 5 -E184, в модулировании активности бис-аммонийных алкановых лигандов.Интересно, что когда все 3 ECL были заменены местами, полученные химерные конструкции M 2 и M 5 функционировали больше как их аналог с замененным рецептором. То есть для конструкции M 2 –M 5 -all-ECL, 4P-C 7 /3-phth оказал незначительное влияние, и хотя ML375 не замедлял диссоциацию [ 3 H] NMS, он немного увеличил скорость диссоциации [ 3 H] NMS, что указывает на аллостерический способ действия (рис. 4 и SI Приложение , таблица S5).Напротив, для конструкции M 5 -M 2 -all-ECL, 4P-C 7 /3-phth замедляла диссоциацию радиолиганда, и, что удивительно, ML375 не оказывал никакого эффекта. Хотя ни одна из химерных конструкций никогда полностью не переключала базальную скорость диссоциации активности [ 3 H] NMS или ML375 на скорость, наблюдаемую для соответствующих конструкций WT, данные тем не менее предполагают, что области ECL модулируют общую конформацию mAChR и напрямую влияют на диссоциация лигандов от ортостерического сайта.

        Обсуждение

        Отдельные подтипы mAChR долгое время рассматривались как лекарственные мишени для ряда расстройств ЦНС, и недавние исследования начали подтверждать валидацию mAChR M 5 в качестве мишени для лечения наркозависимости (4, 40). В этом исследовании мы определили кристаллическую структуру с высоким разрешением mAChR M 5 , что позволило провести сравнение всех подтипов для любого подсемейства аминергических GPCR. Введение мутации, стабилизирующей неактивное состояние S117 3.39 R, который недавно был использован для стабилизации mAChR M 2 (25), имел решающее значение для получения хорошо дифрагирующих кристаллов и предполагает, что эта мутация может быть применена для помощи в определении структур неактивного состояния для других родственных GPCR. Мы дополнительно улучшили разрешение структуры mAChR M 5 , добавив аллостерические модуляторы к очищенному белку перед кристаллизацией. Несмотря на последовательное увеличение разрешения, обеспечиваемое каждым из аллостерических модуляторов, мы не смогли смоделировать какой-либо из модуляторов электронной плотности.С фармакологической точки зрения отсутствие связывания модулятора неудивительно, поскольку все модуляторы, испытанные в этом исследовании, показали сильную отрицательную кооперативность с тиотропием ( SI Приложение , рис. S3 B ). Тем не менее, по-прежнему парадоксально, что добавление аллостерического модулятора может явно улучшить кристаллизацию рецептора и дифракцию, но не видно ни в каких получающихся структурах. Этот феномен был отмечен в других GPCR, таких как M 2 mAChR, который был кристаллизован в присутствии модулятора алкурония, и CC-хемокиновый рецептор 2A, который кристаллизовался в присутствии модулятора AZD-6942, но где ни один модулятор можно было наблюдать в полученных структурах (25, 41).

        Сравнение всех 5 структур mAChR дополнительно подтверждает хорошо законсервированное трансмембранное ядро ​​и ортостерический сайт связывания, что сделало открытие высокоселективных лекарств для этих подтипов рецепторов невероятно сложной задачей. Наиболее очевидные структурные различия между подтипами mAChR находятся в областях ECL. Хотя эти различия, как правило, весьма незначительны, они важны, потому что открывают возможность конструирования селективных молекул способом, который ранее был невозможен ( SI Приложение , рис.S6). Например, недавняя кристаллическая структура mAChR M 2 , связанного с M 2 -селективным антагонистом AF-DX384, показала, что селективность опосредована дифференциальными взаимодействиями между лигандом и остатками в ECL2, которые приводят к смещению наружу в ECL2 и верх TM5 (рис.2 D ) (25). Аналогичным образом, за счет использования знаний об одной аминокислотной разнице в ECL2 между mAChR M 2 и M 3 , молекулярный докинг и дизайн на основе структуры привели к открытию селективного антагониста M 3 со 100-кратным селективность по М 2 мАХР (42).Эти результаты сходны с конструкцией на основе структуры смещенных лигандов, нацеленных на рецептор допамина D 2 , которые были сконструированы с использованием специфических контактов аминокислота-лиганд в ECL2 и TM5 (43). Взятые вместе, эти результаты показывают, что дифференциальное нацеливание на остатки ECL может быть путем создания селективных лигандов mAChR. Это хорошо подтверждается тем фактом, что многие mAChR-селективные аллостерические модуляторы взаимодействуют с областями ECL (27, 34), и предполагает, что создание ортостерических лигандов, связанных с аллостерическими фармакофорами, известных как битопические лиганды, является потенциальной стратегией для будущих структурных препаратов. дизайн.

        Открытие лекарств обычно сосредоточено на оптимизации сродства и селективности лиганда; однако теперь очевидно, что кинетика связывания может играть критическую роль в этих событиях (39, 44–46). Это можно проиллюстрировать двумя способами на примере препарата тиотропий. Во-первых, тиотропий имеет медленную скорость диссоциации от mAChR M 3 , что является ключевой особенностью препарата, позволяющей принимать его один раз в день для лечения хронической обструктивной болезни легких (47). Во-вторых, хотя тиотропий имеет одинаковую аффинность равновесного связывания с mAChR M 3 и M 2 , он демонстрирует кинетическую селективность для mAChR M 3 по сравнению с mAChR M 2 , имея существенно разные скорости диссоциации.Постулируется, что такая кинетическая селективность по отношению к mAChR M 2 обусловлена ​​различиями в электростатике и динамике области ECL (47). M 5 mAChR похож на M 3 mAChR в отношении наличия медленных скоростей диссоциации ортостерического лиганда (20), и данные из наших химер M 2 / M 5 ECL подтверждают идею ECL области, лежащие в основе кинетической селективности при диссоциации [ 3 H] NMS, были переключены между M 2 и M 5 mAChR (фиг.4). Примечательно, что ни одна из объединенных химер ECL никогда не могла полностью переключать кинетику диссоциации между подтипами, указывая на то, что действуют другие механизмы, такие как глобальная конформация ECL. Наши результаты также подчеркивают важность областей ECL для придания чувствительности к аллостерическим модуляторам разных подтипов. Поменяв местами всю область ECL между mAChR M 2 и M 5 , мы смогли полностью изменить чувствительность модулятора, который является селективным для M 2 по сравнению с mAChR M 5 и наоборот.Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями с использованием аналогичных химер M 2 / M 5 mAChR ECL (35–38, 48) и в совокупности с нашими выводами подчеркивают важность области ECL для обеспечения селективности подтипа для различные типы лигандов mAChR.

        Таким образом, описанная нами кристаллическая структура mAChR M 5 позволила сравнить все 5 подтипов mAChR и показала, что тонкие различия в областях ECL являются основным детерминантом селективности лиганда, независимо от того, является лиганд ортостерическим или аллостерическим. .Поскольку mAChR M 1 , M 4 и M 5 продолжают появляться в качестве захватывающих лекарственных мишеней для лечения расстройств ЦНС, важно понимать как структурные, так и динамические различия между всеми 5 подтипами mAChR. чтобы помочь в разработке более безопасных и эффективных низкомолекулярных терапевтических средств.

        Материалы и методы

        Подробная информация о клонировании, очистке рецепторов, синтезе бис-аммонийных алкановых лигандов и экспериментах по молекулярной фармакологии представлена ​​в Приложении SI , Материалы и методы .

        Экспрессия и очистка рецептора M5.

        M 5 -T4L с S117 3,39 R очищали аналогично предыдущим методам (22).

        Кристаллизация и определение структуры.

        Очищенный M 5 -T4L S117 3,39 R, связанный с тиотропием, кристаллизовали с использованием LCP. Для сокристаллизации аллостерического модулятора модулятор добавляли к очищенному белку до конечной концентрации 2,5 мМ. Образец инкубировали на льду в течение 3 часов перед его смешиванием с 10: 1 (вес / вес) моноолеин: холестерин в соотношении 1: 1.Соотношение белок: липид 5 мас. / Мас. Кристаллизацию LCP проводили путем нанесения от 25 до 30 нл образцов на силиконизированный 96-луночный стеклянный планшет, покрывая образцы 600 нл раствора осадителя, используя Gryphon LCP (Art Robbins Instruments). Герметичные стеклянные планшеты инкубировали при 20 ° C. Кристаллы появлялись в первые 24 часа и вырастали до полного размера в следующие 1-2 дня. Лучшие дифрагирующие кристаллы росли в 100 мМ DL-яблочной кислоте, pH 6,0; От 220 до 280 мМ двухосновного тартрата аммония; и от 37 до 41% ПЭГ 400.Для сбора данных собирали целые капли с использованием петель с сеткой (Mitegen) и мгновенно замораживали в жидком азоте.

        Данные по дифракции рентгеновских лучей были собраны на канале SPring-8 (Япония) BL32XU (49) и канале MX2 на австралийском синхротроне (50). Дифракционные данные на SPring-8 были собраны с помощью автоматической системы сбора данных ZOO (51). Дифракционные данные обрабатывали на КАМО (52) с XDS (53). Структура была решена с использованием молекулярной замены M 3 -mT4L (4U15) в качестве модели поиска рецептора и ансамбля молекул T4L для T4L.Уточнение структуры было выполнено с помощью Phenix (54), а модели были проверены с помощью MolProbity (55). Боковые цепи для остатков без электронной плотности (контур 1σ на карте 2m | F o | — D | F c |; SI Приложение , рис. S5) за β-углеродом были усечены. Структурные рисунки были подготовлены с помощью программы PyMol. Электростатический и поверхностный потенциал M 2 и M 5 mAChR (+ 5kT / e в синем и -5kT / e в красном), нанесенный на поверхность рецепторов, рассчитанный при pH 7.0 были рассчитаны с использованием PDB2PQR и APBS (56).

        Доступность данных.

        Координаты атомов и структурные факторы были депонированы в Protein Data Bank, http://www.rcsb.org (код PDB ID 6OL9 для M5-T4L). Подробные методы представлены в приложении SI . Другие материалы и данные доступны по запросу.

        Благодарности

        Эксперименты по синхротронному излучению были выполнены на канале BL32XU на SPring-8 с одобрения Японского научно-исследовательского института синхротронного излучения (JASRI) (предложение №2017B2731) и луч MX2 на австралийском синхротроне (CAP13670). Эта работа финансировалась за счет гранта Wellcome Trust Collaborative Award (201529 / Z / 16 / Z) и при поддержке Национального совета здравоохранения и медицинских исследований Австралии (NHMRC), проектный грант APP1138448 и программный грант APP1055134 и APP1150083. J.B.B. является главным научным сотрудником NHMRC; P.M.S. и A.C. являются старшими научными сотрудниками NHMRC; и D.M.T. — научный сотрудник Австралийского исследовательского совета Discovery в начале карьеры.

        Сноски

        • Автор: Z.V., P.R.G., J.B.B., A.C. и D.M.T. спланированное исследование; Z.V., P.R.G., A.E.B., K.H., S.V., G.T., E.T.v.d.W., W.A.C.B. и D.M.T. проведенное исследование; Z.V., P.R.G., S.V., R.R., C.W.L., J.B.B. и D.M.T. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; Z.V., P.R.G., A.E.B., K.H., C.V., C.J.L. и D.M.T. проанализированные данные; и Z.V., P.R.G., S.V., A.B.T., P.M.S., A.C. и D.M.T. написал газету.

        • Авторы заявляют об отсутствии конкурирующей заинтересованности.

        • Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

        • Размещение данных: данные, представленные в этой статье, были депонированы в банке данных белков (PDB), https://www.rcsb.org/ (PDB ID 6OL9).

        • Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу https://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1

          6116/-/DCSupplemental.

        • Авторские права © 2019 Автор (ы). Опубликовано PNAS.

        ‘Godzilla Vs. Kong ’приближается к 28 миллионам долларов в первые три дня — крайний срок

        Воскресенье AM ФИНАЛ: Кто бы ни сказал, что посещение фильмов должно остаться мертвым или что потоковая передача победила, должен вернуться в бизнес-школу.Потому что фильм о большом событии плюс праздничные выходные, а также вновь открывшиеся выставочные площадки Лос-Анджелеса и Нью-Йорка стоили больших денег. По кассовым сборам, фильм Warner Bros./Legendary , , Годзилла против Конга, , , разрушил все прогнозы отрасли с 5-дневными кассовыми сборами в размере 48,5 млн долларов после субботнего сбора за 12,5 млн долларов, что на 8% выше . Годзилла против Конга 3-дневный прогноз составил $ 32,2 млн. , и это верхний предел 5-дневного прогноза, который был сделан перед его открытием в среду. Должно быть много руководителей WarnerMedia, которые рады, что Godzilla vs.Kong никогда не продавался Netflix.

        «Чудовищные результаты по всем Соединенным Штатам. «Зрители с нетерпением ждут фильмов в кинотеатрах на большом экране с большим звуком», — воскликнул сегодня утром босс внутреннего распространения Warner Bros.

        Связанная история

        Годзилла против. Режиссер Конг Адам Вингард снимет фильм «Громовые коты» для Warner Bros

        Warner Bros. первой зажгла театральный рынок во время пандемии.Они начали безопасно открывать кинотеатры с Tenet еще в августе. Теперь студия, наконец, стала рекордсменом по кассовым сборам, поскольку количество прививок растет, а число случаев Covid сокращается по всей стране.

        «Этот фильм представляет собой способ для людей постепенно вернуться в социальную среду, — говорит Deadline Джош Гроуд, генеральный директор Legendary Entertainment. — Возвращаясь в кинотеатры и узнавая, что мы не заболеем; именно эти шаги мы предпринимаем в течение следующих двух-трех месяцев, чтобы вернуться к нормальной жизни.Это фильм для многих людей, которые делают первый шаг ».

        B.O. в эти выходные для Годзилла против Конга стал отличным знаком для кинобизнеса и кинотеатров, что пандемия не привела к исчезновению кино.

        Голливудский руководитель, специализирующийся на потоковом вещании, может подумать, что это возможность объявить об успехе кинематографической и потоковой модели HBO Max от WarnerMedia.

        Нет, нет, нет, нет, нет!

        Warner Bros

        Подумайте обо всех деньгах, которые Годзилла vs.Конг мог бы выступить в эти выходные без HBO Max . Годзилла против Конга. Кассовые сборы здесь являются показателем этого, даже с частично открытой Канадой. Чтобы не допустить дождя на параде Warner Bros. здесь, потому что они действительно сделали эту победу так, как ни один другой стример с театральным титулом не смог. Но добавление HBO Max к Godzilla vs. Kong просто вычитает продажи билетов или истощает то, что могло бы быть другим окном. Поскольку студии, такие как Disney, стремятся подкрутить выставку к условиям аренды с помощью дня и даты выпуска кинотеатров, таких как Black Widow, , и придерживаются странной бизнес-философии, согласно которой «потребители будут смотреть фильмы там, где они хотят их видеть», — абсолютная сила из Годзилла vs.Kong , прошедший в эти выходные, доказывает, что кино и театр по-прежнему остаются королем.

        WarnerMedia не предоставила точных числовых статистических результатов относительно того, как Годзилла против Конга на HBO Max в минувшие выходные. Однако Энди Форселл, исполнительный вице-президент и генеральный директор WarnerMedia Direct-to-Consumer сказал следующее: «Аудитория HBO Max говорила очень четко и громко: им нравится этот фильм, и они смотрят его не раз. Сравнение показателей аудитории за первые четыре дня с момента выпуска
        : Godzilla vs.У Kong была большая аудитория, чем у любого другого фильма или шоу на HBO Max с момента запуска ».

        Единственный кинотеатральный релиз во всей его славе Imax, PLF или Dolby делает часть IP эксклюзивной и премиальной и способствует увеличению доходов вспомогательной цепочки. Затем студия может сохранить некоторую эксклюзивность этого названия, вызвать ожидание у тех, кто, возможно, не видел его, и продать его в другом окне, даже если у нее появляется больше подписчиков на HBO Max. Теперь Warners уже указали, что они перейдут к своим фильмам о событиях с модели театрального HBO Max, учитывая их недавнее 45-дневное театральное окно с Regal на 2022 год.Кроме того, театральный план HBO Max на 2021 год был предназначен только для этого года, поскольку страна постепенно выходит из пандемии.

        Warner Bros

        Еще не решено, будет ли другая игра Legendary Warner Bros., , Dune , выходить день и ночь в кинотеатрах и на HBO Max. И это несмотря на то, что последний потоковый сервис продолжает продвигать его в рамках своего пакета 2021 года. Успех Годзиллы против Конга в минувшие выходные стал явным аргументом в переговорах Legendary с Warner о том, чтобы этот звездный научно-фантастический фильм оставался только в кинотеатрах.

        Есть несколько вторых и третьих сторон, которые извлекают выгоду из славы Годзиллы против Конга i в экосфере внутреннего BO, а не только Warner Bros. Exhibition, Imax, Dolby, концессионные компании и т. Д. успех этого фильма, снятого Адамом Вингардом.

        В целом, Comscore сообщает, что все фильмы в прокате по выходным в стране собрали 44,7 миллиона долларов, лучших трех дней, которые мы когда-либо видели с начала пандемии в середине марта, + 143% по сравнению с прошлыми выходными, и получаем: +109000 % с того же кадра год назад.Кассовые сборы 2021 года до 4 апреля составят 261,6 миллиона долларов, что составляет -83% от 1,8 миллиарда долларов, которые в 2020 году были собраны в период с января по первые выходные апреля.

        Просто посмотрите, как этот четвертый квел в целом способствовал развитию индустрии. По данным Comscore, весь рынок Лос-Анджелеса за последние два дня для всех фильмов составил 2,16 млн долларов (обратите внимание, что кинотеатры округа Лос-Анджелес не выходят на 50% до понедельника, но округ Ориндж — на 50%), Нью-Йорк собрал 1,56 млн долларов ( емкость этого рынка по-прежнему составляет 25%, и неизвестно, когда она сразу вырастет до 50%), Даллас Форт-Уэрт получил 1 доллар.34M и Houston прибавили 1,06 миллиона долларов. Такого типа кассовых сборов по городу в отрасли давно не было.

        Вслед за отечественным Б.О. Усталость от Годзиллы: Король монстров 2019 года, дистанция была указана в календаре уже для этого четвертого квела во время подготовки к пандемии.

        Легендарный генеральный директор Джош Гроуд
        Ирелл и Манелла

        Гроуд рассказывает Deadline: «Мы провели много аналитики после King of the Monsters, , и аудитория показала, что они хотят увидеть, как эти монстры взялись за дело.Этот фильм дает зрителям то, что они хотят, и мы видим результаты ».

        На Годзилла против Конга было много аншлагов. Как мы уже говорили перед открытием, фильм собрал рекордное количество частных залов в 10 тысяч, больше, чем любой другой фильм во время пандемии.

        Отечественные аудитории Imax составили 9,3% от общего количества шоу Godzilla по сравнению с 5-дневными кассами Kong или $ 4,5 млн , с более чем 1 тыс. Аншлаговых шоу (что составляет около 25% всех доступных шоу IMAX выходного дня).Этот внутренний номер Imax — лучший, который экспонент широкоформатной выставки видел более года с Bad Boys for Life в январе 2020 года.

        Годзилла против Конга Топ-10 рынков: Лос-Анджелес, Нью-Йорк, Даллас, Хьюстон, Феникс, Чикаго, Сан-Франциско, Солт-Лейк-Сити, Орландо и Атланта.

        10 лучших локаций для GvK : 1. Cinemark Tinseltown El Paso, 2. AMC Burbank Los Angeles, 3. Santikos Palladium San Antonio, 4. AMC Orange Los Angeles, 5.Объединенный стадион Виктория Уорд, Гонолулу, 6. AMC Эдинбург, Техас, 7. AMC Disney Springs, Орландо, 8. AMC Gulf Pointe, Хьюстон, 9. Santikos Casa Blanca, Сан-Антонио, и 10. Cinemark Pharr Town Center, Техас.

        У Warner Bros были театральные и PVOD-релизы для Godzilla vs. Kong в Канаде, которые принесли дополнительные 3 миллиона долларов, согласно сообщению студии для прессы в этом AM.

        Итак, что будет дальше после Годзиллы против Конга? Studios должны рассматривать это как многообещающий знак для продвижения более широких выпусков, а не отступать, как это было после открытия Tenet. Warner Bros. уже создала некоторую взлетно-посадочную полосу для Godzilla vs. Kong , чтобы, мы надеемся, побороться, продвигая свою долгожданную функцию New Line R с рейтингом Mortal Kombat в неделю с 16 по 23 апреля.

        Что касается фильмов о Годзилле или Конге, то сегодня утром Гроуд сказал: «У нас есть несколько идей для большего количества фильмов». На четырех фотографиях франшиза собрала 1,76 миллиарда долларов.

        Опять же, если какой-либо голливудский руководитель спрашивает, где люди хотят смотреть фильмы — в кинотеатрах или дома, — явно не дома.

        Ду.

        ****

        Фото Тобиаса Датума. Предоставлено Sony Pictures Classics

        Прочие B.O. примечания: Sony, которая не потратила деньги на P&A, чтобы продвинуть The Unholy , как это сделала Warner’s с GvK, называет место № 2 с 3,2 млн долларов за титул Screen Gems horror PG-13. . С другой стороны, Sony Pictures Classics номинирована на «Золотой глобус» на French Exit драма с Мишель Пфайффер и Лукасом Хеджесом в главных ролях входит в десятку лучших с $ 193K .

        Компания Atlas Entertainment представила фильм о вере Миры Сорвино Девушка, которая верит в чудеса в 640 кинотеатрах на 154 рынках. Картинка лучше всего воспроизводилась в религиозных треках Далласа, Хьюстона, Сан-Антонио, долины Рио-Гранде и Феникса, однако цифры для этих христианских фильмов пока не дотягивают до уровня, предшествующего пандемии.

        Топ-10 чартов — ежедневные сборы по данным студии:

        1.) Годзилла против Конга (WB / Leg) 3064 кинотеатра / среда $ 9.6 мес. / Чт 6,7 млн ​​долл. / Пт 11,6 млн долл. США / сб 12,5 млн долл. США / 8,1 млн долл. США вс / 3 дня 32,2 млн долл. США /5 дней 48,5 млн долл. США / нед 1

        2.) The Unholy (Sony) 1850 кинотеатров пт 1,2 млн долл. / Сб 1,2 млн долл. / Вс 770 тыс. Долл. / 3,2 млн долл. / нед 1

        3.) Никто (Uni) 2567 кинотеатров (+107) Пт 1,06 млн долларов / сб 1,22 млн долларов / вс 790 тыс. Долларов / 3 дня: 3,07 млн ​​долларов (-55%) / Всего 11,8 млн долларов / нед 2

        4.) Рая и последний дракон (Dis) 2031 кинотеатр (-181), пт 800 тыс. Долл. / Сб 761 тыс. Долл. / Вс 493 тыс. Долл. / 3 дня: 2 долл. США.05M (-45%), Итого: $ 32,1M / Неделя 5

        5.) Tom & Jerry (WB) 2273 кинотеатра (-191), 3-дневный: 1,4 миллиона долларов (-48%) / Всего: 39,5 миллиона долларов / неделя 6

        6.) Девушка, которая верит в чудеса (Атлас) 640 кинотеатров 3 дня $ 526K / нед.1

        7.) The Courier (ЮАР) 1322 кинотеатра (-319), пт 165 тысяч долларов / суббота 174 тысячи долларов / вс 113 тысяч долларов / 3 дня: 452 тысяч долларов (-57%) / Всего: 4 долларов .2M / нед 3

        8.) Chaos Walking (Lionsgate) 1605 кинотеатров (-431), пт 134 000 долл. / Сб 149 000 долл. / Вс 98 000 долл. / 3 дня: 380 000 долл. (-69%) / Всего: 12,2 млн долл. США / нед 5

        9.) The Croods: A New Age (Uni) 1212 кинотеатров (-107), пт 81 тысяча долларов / суббота 76 тысяч долларов / вс 53 тысячи долларов / 3 дня: 210 тысяч долларов (-62%) / Итого: $ 56,3 млн / недель 19

        10.) French Exit (SPC) 483 кинотеатра на 3 дня 193 тыс. Долл. США / всего 200,5 тыс. Долл. США в неделю 8

        Обновление в субботу: Годзилла vs.Kong теперь вырос до 27,9 млн долларов за три дня после 11,6 млн долларов в пятницу в 3064 местах, + 73% за четверг. Прогноз на 5 дней для Warner Bros./Legendary, снятого Адамом Вингардом, составляет $ 42 млн. — безусловно, лучшее начало (3- и 5-дневное), которое мы видели на внутреннем B.O. во время пандемии, то есть с середины марта 2020 года.

        «Индустрия возвращается назад, когда невероятная производительность Godzilla против Kong должна заставить замолчать скептиков, которые предсказывали, что из-за пандемии и, как следствие, привлекательности домашнего просмотра, опыт на большом экране исчезнет, ​​как — доисторическая ящерица », — сиял сегодня утром старший медиа-аналитик Comscore Пол Дергарабедян.

        Замечательная вещь здесь с Годзилла против Конга заключается в том, что его предшественник 2019 года с трехдневным внутренним открытием стоимостью 47,8 миллиона долларов был признан неудачным, демонстрируя большую усталость в США от франшизы Legendary Monster после больших открытий Godzilla 2014 года. (93,1 миллиона долларов) и Kong: Skull Island (61 миллион долларов). В ответ Warner Bros. переместили Годзилла против Конга дальше по календарю, с 13 марта 2020 года на выходные перед Днем благодарения в том же году, чтобы освободить место для Короля монстров; это было задолго до того, как пандемия взорвала весь календарь релизов в кинотеатрах.Возвращаясь к 2016 году, Годзилла против Конга впервые был датирован кадром выходного дня после Дня поминовения в 2020 году.

        На июньской конференции PGA Produced By Conference председатель Warner Bros. Studio Тоби Эммерих сказал, что Годзилла против Конга будет достаточно отложен, чтобы студия могла «доставить фанатам то, что они искали … кино.» И фильм, близкий к A +, Warner Bros. действительно поставил в Godzilla vs. Kong с A Cinemascore, а группа моложе 18 лет, обнимающая монстр-мэш-фильм с A +.

        В преддверии выходных шум в социальных сетях о Godzilla vs. Kong вызвал бурю: 9 из 10 на счетчике болтовни RelishMix.

        «Поклонники пытаются сдержать свой энтузиазм по поводу большого праздника попкорна с призывом к начо. Поклонники потеряли всякое представление о глобальной пандемии из-за неистовой болтовни: «Этот военный корабль заслуживает Оскара за лучшую роль второго плана, чтобы иметь возможность поддержать их обоих, не утонув», — сообщает корпорация аналитиков социальных сетей.

        Это ясно Warner Bros.потратил на то, чтобы открыть этот фильм в кинотеатрах в рамках объединенной театральной кампании HBO Max, чего не сделал Дисней в своем ежедневном выпуске фильма «Райя и последний дракон» в кинотеатрах Disney +.

        RelishMix также добавляет, что виртуальные маркетинговые кампании Warner Godzilla vs. Kong «перевернулись» в социальных модулях студии для Warner Bros. Pictures 53,8M, HBO Max 1,8M и Legendary Pictures 2,1M.

        «Триангуляция питает вселенную социальных сетей, которая чрезмерно индексируется на уровне 530.4M, что на 187% больше, чем обычно для жанра боевиков в жанре научной фантастики ». Обратите внимание, что это потрясающие результаты онлайн-трафика для пандемии. Поскольку кинотеатр закрылся на время карантина, то же самое произошло и с показом фильмов в социальных сетях, и количество зрителей в социальных сетях стало еще одним показателем того, что киноиндустрия возвращается в нормальное русло.

        Годзилла против Конга был супер-популярным на YouTube. У Warner Bros. было только два видео для этого воплощения, трейлер и рекламный ролик, которые были опубликованы и разорваны-репостаны с огромной вирусной скоростью 44: 1, набрав 409 миллионов просмотров за восемь недель по всему миру, и 79 миллионов просмотров для U.Трейлер S.WB, 23M на латиноамериканском канале и 9.3M на британском канале WB. «Конечно, все студии продвигают свои трейлеры, но главный трейлер US Warner Bros. имеет более 250 тысяч комментариев, что очень хорошо», — говорит RelishMix.

        Что касается актерского состава, RelishMix отмечает, что Годзилла против Конга Звезда Александр Скарсгард «на удивление полусоциальный, Милли Бобби Браун имеет наибольший социальный охват с SMU 48,2 млн, но приз получает Эйса Гонсалес. для большинства активированных накладывается отложенная, а затем обновленная кампания.”

        Некоторые из других маркетинговых моментов для GvK включают вызов в Instagram, где фанаты голосуют за конкурирующие фильмы, которые они хотят посмотреть:

        Кроме того, все режиссеры фильмов о монстрах Legendary собрались для церемонии отпечатка рук в день открытия Китайского театра TCL в понедельник, 29 марта. Кроме того, как мы можем забыть, но вот как активность GvK на TikTok ищет:

        На втором месте по итогам уик-энда находится боевик Боба Оденкирка компании Universal с рейтингом R Никто с $ 2.78M , -59% на прогнозируемый 10-дневный курс $ 11,5M в 2,567 кинотеатрах. Ожидалось, что Никто не проиграет в выходные 2 из-за потери территории PLF против Годзиллы против Конга. Никто из не заработал 1,02 миллиона долларов в пятницу, что на 59% меньше, чем неделю назад.

        Нечестивый
        Sony

        Sony / Screen Gems ‘ Ужасный фильм «Нечестивый» , похоже, займет 3-е место в выходные после предполагаемого $ 1,2 млн. в пятницу и трехдневного открытия к северу от $ 2.755M в 1850 кинотеатрах. Я слышал, что фильм получил оценку C + CinemaScore и грешную оценку 31% на Rotten Tomatoes. Выходы PostTrak были хуже: 52% в первых двух боксах и 37% рекомендуют. Разделение мужчин и женщин составило 50/50, 53% из них старше 25. Демо разнообразия: 37% европеоиды, 33% латиноамериканцы, 18% чернокожие и 12% азиаты / другие. RelishMix увидел, как огонь и сера поднимаются против Unholy в социальных сетях перед открытием уик-энда, сообщая: «Convo на The Unholy течет посередине со смешанной болтовней, склоняющейся к негативному взгляду Голливуда на религию, дьявол, 666, Мать Марию. и Пасха, пока некоторые фанаты молятся друг за друга в тредах.В целом, социальный охват и вовлеченность для The Unholy «быстро упали» согласно RelishMix: 62,1 млн социальных сетей, построенных на каналах Sony, и студия, открывшая свою главную страницу в Facebook, насчитывающую 29,1 млн поклонников, «вместо того, чтобы создавать новую один, который представляет собой тактику разворота пандемии, используемую с сокращением рекламных площадок ». Количество просмотров на YouTube приближается к 10 миллионам, при этом один трейлер был снят три недели назад, а десять видео были быстро опубликованы на Facebook с 4,7 миллионами просмотров.

        Disney Raya and the Last Dragon , , который также доступен на уровне Disney + Premier за дополнительные 30 долларов, принес 800 тысяч долларов в 5-ю пятницу в 2031 месте, что, похоже, будет на выходные около долларов 2 миллиона , -47%, на 4-м месте и на общую сумму $ 32.1М .

        Warner Bros. ‘ Tom & Jerry занимает пятое место по итогам уик-энда, имея 500 тысяч долларов в пятницу и около 1,2 миллиона долларов , -52% в 6-й уик-энд с общей суммой 39,3 миллиона долларов. .

        Обновление в пятницу: Warner Bros./Legendary’s Godzilla vs. Kong вчера заработали 6,7 млн ​​долларов, снизившись на 30%. Таким образом, общая сумма за два дня фильма, снятого Адамом Вингардом, составила 16,3 миллиона долларов на 2409 сайтах. В эти выходные количество кинотеатров вырастет до 3064, так как 22 кинотеатра Regal вновь открываются из 542 кинотеатров в Лос-Анджелесе, Хьюстоне, Техас и Калифорнии.Пятидневная оценка для GvK теперь повышается до 30-40 миллионов долларов, причем изображение доступно и на HBO Max. Сегодняшний день обещает быть многообещающим для фильма, так как 76% школ K-12 отправились на каникулы в Страстную пятницу.

        Страстная пятница в последние годы в период перед пандемией была успешным днем ​​в прокате. Рекордсменом является Warner Batman v. Superman с 81,6 млн долларов в 2016 году, за которым следует Universal Furious 7 в 2015 году с 67,4 млн долларов. Это при полной выставочной площади в 5,88 тыс. Кинотеатров, действующих в США.С. и Канада. Хотя ни один фильм о событии не достигнет этих цифр в течение некоторого времени, пока ограничения по вместимости не будут сняты и пока не будут полностью открыты Canada и Regal, это просто дает вам представление о том, сколько еще можно заработать в кассе. Никто не отказался полностью от кинематографа, что ясно видно в отскоке GvK .

        Предыдущий четверг AM: В среду кинозрители продемонстрировали, что они действительно хотят вернуться в кино.

        Как это?

        Warner Bros / Legendary’s Годзилла vs.Kong опубликовал рекордный день открытия во время пандемии: 9,6 миллиона долларов в местных кассах из 2409 кинотеатров или 3980 долларов за место. С середины марта 2020 года, когда кинотеатры закрылись и медленно вернулись в конце августа, ни один другой фильм не занимался подобным бизнесом. Хотя люди могут смотреть Годзилла против Конга дома на потоковом сервисе WarnerMedia HBO Max в течение следующих 30 дней, есть те, кто хочет выйти и испытать это столкновение монстров в грохочущей аудитории на большом экране. экран.

        Прогноз кассовых сборов в эти выходные за пять дней для Godzilla vs. Kong составил 20-30 миллионов долларов; Надеюсь, фильм легко превзойдет это. Мы говорим «надеюсь», потому что не знаем, насколько загружен первый день среды. Тем не менее, это обнадеживающий знак для киноиндустрии.

        Имейте в виду, MGM No Time to Die изначально планировалось открыть в пасхальные выходные, а когда это было перенесено на осень из-за надежды на доступность большего количества оффшорных рынков, Warner Bros.перенесла Годзилла против Конга в то, что традиционно считается прибыльным праздником Б.О. выходные .

        До Годзилла против Конга, именно Wonder Woman 1984 компании Warner Bros. завоевали лучший титул первого дня открытия во время пандемии с 7,5 миллионами долларов 25 декабря.

        Также большим плюсом здесь является то, что из уст в уста Годзилла против Конга — лучшее, что когда-либо было для фильма о легендарном монстре с A Cinemascore, попирая оценки B +, заработанные Годзиллой 2014 года, Kong: Череп 2017 года Остров и Годзилла 2019 года: Король монстров. Comscore / Screen Engine выходит из аудитории PostTrak также хорошо: 86% и 4 1/2 звезды, а также 74% определенных рекомендаций.

        Годзилла против Конга — первая игра, которая будет играть в 3000 кинотеатрах, которые выйдут в пятницу, когда Regal вновь откроет 22 своих лучших места в США, включая их 42-ю улицу в Нью-Йорке и L.A. Live среди многих других. В целом, в пятницу добавлено 655 локаций, в общей сложности 3064 кинотеатра.

        PLF обеспечили 17% бизнеса GvK в среду, а Imax — 8%.Имейте в виду, что большая часть Канады закрыта, и открыто только 25% выставок страны, а монстры-пюре, созданные Адамом Вингардом, в основном доступны на Premium VOD.

        Среда демонстрации для GvK показывают 63% парней (которые оценили его A), 37% женщин (A), до 18 лет — 24% (A +), до 24 лет (48%, A), старше 25 (52%, A). -), до 35 лет (72%, A) и старше 35 (28%, A-). Четвертый квел имеет лучший результат из всех фильмов о легендарных монстрах: 80% Certified Fresh, лучше Godzilla — 76%, Kong: Skull Island — 75% и 2019 — Godzilla: King of the Monsters ‘ужасно гнило на 42%.

        афроамериканская аудитория дала GvK 92% положительных оценок и 85% определенных рекомендаций на PostTrak. В первый день демонстрации разнообразия на картинке были 33% европеоидов, 27% латиноамериканцев, 23% афроамериканцев, 10% азиатов и 7% коренных американцев / других.

        Нечестивый
        Самоцветы экрана

        Также в пятницу открывается фильм ужасов The Unholy Screen Gems в 1850 кинотеатрах, который, как предполагается, будет показывать очень низкие одномиллионные цифры.Последним заметным фильмом Sony во время пандемии, если хотите, был фильм Monster Hunter, , который был продан за 2,2 миллиона долларов в 1736 кинотеатрах с 18 по 20 декабря. У Нечестивого еще нет рейтинга Тухлых Помидоров.

        Фильм PG-13 основан на книге Джеймса Герберта Shrine , продюсерами Ghost House Pictures Сэм Рэйми и Роб Таперт и Эван Спилиотопулос, который также является сценаристом и режиссером картины. Джеффри Дин Морган, Кэти Аселтон, Уильям Сэдлер, Диого Моргадо, Крикет Браун, Марина Мазепа и звезда Кэри Элвиса.В Unholy, Дева Мария посещает слабослышащую девушку, которая внезапно может слышать, говорить и исцелять больных. По мере того, как люди стекаются, чтобы засвидетельствовать ее чудеса, разворачиваются ужасающие события. Это работа Девы Марии или что-то более зловещее?

        M5 Стек

        Мы заметили, что количество проектов и участников, связанных с COVID-19, быстро растет. Пока что за последний год эти проекты просмотрели множество уникальных пользователей. Стремясь улучшить ответ на пандемию COVID-19, M5Stack в сотрудничестве с NYP (Nanyang Polytechnic) — это политехнический институт, расположенный в Сингапуре, совместно с ESPRESSIF над проектами COVID-19, которые помогают людям защитить себя.

        В связи с пандемией COVID-19 процесс судейства конкурса M5Stack и NYP Project Based Learning Design Challenge проходит в режиме онлайн. Генеральный директор M5Stack Джимми и заместитель генерального директора ESPRESSIF Станца Ван в качестве основных членов жюри оценивают заявки и дают некоторые предложения по улучшению проекта. Ниже представлены проекты-победители в этом испытании. Мы пишем эту новость, надеемся, что больше людей откроют для себя эти проекты. Все проекты будут опубликованы на Hackster.io.

        1 место

        Covid Tracker

        Covid Tracker — это устройство, которое призвано повысить эффективность процесса регистрации, а также предоставить пользователям данные в реальном времени, чтобы избежать скопления людей и снизить влияние COVID-19 на нашу повседневную жизнь, находя баланс между безопасностью и комфортом.

        Нажмите здесь , чтобы узнать больше о проекте.

        2 место

        Гигиена рук

        Hand Hygienics направлена ​​на сокращение распространения Covid-19 путем поощрения людей к тщательному и правильному мытью рук. Команда стремится решить следующие проблемы.
        Напомнить людям о необходимости мыть руки
        Обеспечить наличие мыла, важного ингредиента для уничтожения микробов
        Убедитесь, что используется мыло
        Убедитесь, что люди моют руки не менее 20 секунд
        Покажите людям, как правильно мыть руки

        Щелкните здесь , чтобы узнать больше о проекте.

        Tap and Go

        Tap And Go — это замена безопасного входа. Это может уменьшить продолжительность очереди, и это более удобно.

        Нажмите здесь , чтобы узнать больше о проекте.

        3 место

        Автоматизированная станция профилактики Covid-19 в библиотеках

        Этот проект направлен на борьбу с COVID-19. Команда стремится установить станцию ​​в библиотеках. Посетители должны будут пройти через него, прежде чем продолжить. Станция будет иметь возможность контролировать толпу, дезинфицировать посетителей и отображать количество текущих посетителей.Это полностью автоматизированное устройство, позволяющее контролировать количество людей в библиотеке без вмешательства человека. За счет ограничения количества людей и их дезинфекции риск передачи COVID-19 резко снизится.

        Нажмите здесь , чтобы узнать больше о проекте.

        Хомяк проекта

        Проект используется для отслеживания количества людей, входящих и выходящих из определенного места, путем подсчета и получения их UID для определения их местонахождения.Кроме того, он может выдавать дезинфицирующее средство, когда кто-либо нажимает кнопку A. Следовательно, ограничение, контроль, дезинфекция и отслеживание количества людей в любом общественном транспорте. Это простое, но полезное устройство, которое пригодится.

        Нажмите здесь , чтобы узнать больше о проекте.

        Q-Bot

        Мы стремимся создать робота, который будет эффективно дезинфицировать поверхности, не нанося вреда чистящим средствам.

        Нажмите здесь , чтобы узнать больше о проекте.

        О M5Stack
        M5Stack — технологическая компания, базирующаяся в Шэньчжэне, Китай, специализирующаяся на проектировании, разработке и производстве наборов инструментов и решений для разработки Интернета вещей.

        Мы стремимся предоставлять полнофункциональные, настраиваемые и экономичные наборы инструментов разработки IoT с открытым исходным кодом, а также простую платформу программирования «UIFlow» и решения AIoT для умного города, умного сельского хозяйства, коммерческих целей, индустрии 4.0, робототехники и обучения STEAM.

        M5Stack выполняет миссию «Быстрая и легкая разработка Интернета вещей», с помощью простых в разработке устройств и решений мы можем преодолеть разрыв между разработкой и конечным продуктом, тем самым воплотив творческие мечты в реальность!

        Мужские шорты Baggies ™ Patagonia — 5 дюймов

        Талия Внутренний шов *
        XX-малый 26 год 31 год
        X-маленький 28 год 31 год
        Малый 29 31 год
        Средний 31 год 32
        Средний 32 32
        Средний 33 32
        Большой 34 33
        Большой 35 год 33
        Большой 36 33
        Большой 38 33
        Большой 40 33
        XX большой 42 33
        XX большой 44 год 33
        XXX большой 46 33
        XXX большой 48 33

        Измерения относятся к размеру тела, а не к размерам одежды, и приводятся в дюймах, если не указано иное.* Внутренний шов зависит от стиля; когда предлагаются длины, «короткое» — 30, «обычное» — 32 и «длинное» — 34, если не указано иное.

        Хотя каждый продукт Patagonia® разработан и сформирован специально для предполагаемого использования, мы можем обобщить наши описания пригодности четырьмя способами:

        Облицовка

        По контурам тела.

        Slim Fit

        Облегающий. Облегающую техническую одежду можно носить поверх нижнего и легкого промежуточных слоев.

        Стандартный

        Ни тонкие, ни большие. Техническую одежду стандартного кроя можно носить поверх более плотного среднего слоя.

        Свободный покрой

        Неплотно прилегает к телу.

        .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *