Удлиненная приора: Lada Priora Premier — фото, цена и технические характеристики

Содержание

Lada Priora Premier — фото, цена и технические характеристики

Жители России могут встретить на дороге и даже приобрести удлиненную версию Lada Priora – “Premier”, либо же ее двух дверную версию “Coupe”. А в соседних Украине или Белоруссии большинство автолюбителей даже не подозревают о существовании подобных модификаций Лады Приоры. Удлиненные автомобили Лада Приора Премьер оснащаются практически неизвестными для широкой публики двигателями. Силовые агрегаты наделяют автомобиль лучшей тягой, по сравнению с обычной Priora. И, конечно же, такой автомобиль приобретается в первую очередь из за большого запаса пространства на заднем сидении.
Кроме того модификация Lada Priora Premier создается не на «АвтоВАЗ», ее собирают из поставляемых запчастей на предприятии ЗАО «Супер-Авто». Это предприятие специализируется на мелкосерийном выпуске специальных моделей ВАЗ.

Все 175мм прибавки пошли в колесную базу автомобиля, а именно в район задних сидений автомобиля. Лада Приора Premier имеет такую же ширину как и обычная Priora, но прибавка колесной базы дала возможность двоим людям очень вольготно расположиться на задних сидениях. По пространству для ног машина сопоставима с добротным седаном класса C, или универсалом этого же класса.

Материалы отделки по качеству изготовления возможно и не дотягивают “максимальных комплектации” иномарок гольф-класса, но отделка версии “Премьер” конечно по уровню значительно выше “стандартной Priora”. Сидения обшиты качественным материалом, но пластик преимущественно жесткий. Торпедо Lada Priora Премьер может быть отделано вставками под дерево. Причем вставки достаточно массивны и покрывают значительную площадь панели. Имитация дерева в Приоре смотрится конечно же не так, как на Range Rover, но такая панель смотрится значительно привлекательней, чем та что предлагается “в базе”.

Экстерьер машины достаточно гармоничен. Главное внешнее отличие от стандартной Priora это вертикальная вставка в стекле задней дверцы. Сама же задняя дверь помимо более привлекательного внешнего вида предоставляет более удобную посадку на второй ряд сидений. Подобный прием уже давно используют немцы на своих премиальных седанах, версия «Long» всегда получает прибавку длины именно в заднюю дверь. Удлиненный автомобиль выдают колесные диски большего диаметра, на Priora Premier устанавливаются 15-ти дюймовые колеса. В остальном удлинение прошло для седана практически “безболезненно”. Машина смотрелась бы еще более гармонично если бы заднее стекло было цельным (без прямоугольника). Наверняка это связано с удешевлением производства, ведь цельные стекла пришлось бы заказывать отдельно, а стандартные уже есть на АвтоВАЗ. Помимо задних дверей все остальные кузовные панели остались прежними.
Машина, как мы уже отметили, подросла в длину, теперь она фактически является полноправным седаном класса С (по длине даже несколько выбивается из него). Хотя производитель относит и обычную Priora к гольф-классу, её соответствие данному классу – вопрос спорный, а вот Premier на 100% соответствует этому классу автомобилей.

То что автомобиль стал иным заметят не только сидящие сзади. Самому водителю места хотя и не прибавилось, но за счет увеличенной колесной базы автомобиль стал более плавным и комфортным, он легче преодолевает дорожные неровности. В эксплуатации машина удобна еще тем, что объем багажника хоть и не самый большой в классе, но 430 литров будет достаточно для “обычных потребностей” в перевозе багажа. Сама же погрузочная высота не велика – удобно укладывать тяжелые вещи. Отдельно стоит упомянуть о достаточно широком проеме багажного отделения, ведь бывает так- когда объем багажника велик, но проем узок, габаритные вещи засунуть просто не получается. По багажному отделению машина выигрывает у многих иностранных автомобилей этого ценового сегмента.

Машина значительно лучше ведет себя на высоких скоростях и не требует частых подруливаний даже на шоссе с плохим покрытием. Всего этого удалось достичь благодаря увеличенной колесной базе.
По сравнению с “обычной Приорой” версия Premier оснащена усиленной коробкой передач, она легче переносит быстрые наборы скорости.
Если говорить о технических характеристиках, то Lada Priora Premier имеет под капотом “свой” двигатель. Объем мотора 1.8 литра, он развивает более высокий крутящий момент в сравнении с донорской машиной. 162Н.М очень уверенно тянут автомобиль вперед. Максимальная скорость “Премьер-версии” превосходит “обычную Priora с 1.6″ и составляет 195 км. Машина в смешанном цикле расходует 7.2 литра 95-го бензина на 100 километров пробега. На Приору Premier устанавливается сцепление Lucas, которое зарекомендовало себя как надежный узел способный выходить более 100 000 км.
Габариты автомобиля Лада Приора Премьер составляют: 4525 мм длина, 1680 мм ширина и 1420 мм ширина. Снаряженная масса составляет 1100 кг. Машина оснащена той же главной парой, что и “просто Priora”, но более приемистый двигатель легче раскручивает ГП числом 3.7.

Цена седана Lada Priora Premier стартует с отметки ~450 000р. (в комплектации “люкс”). В данной комплектации эта машина оснащена соответственно “люксовой Приоре”, плюс дополнительные элементы безопасности в конструкции. Опционально может быть предложен кожаный салон, передняя панель со вставками под дерево и ксенон.
ЗАО « Супер-Авто» так же представила специальную версию Лада Приора Premier для работы в такси. Такая модификация оснащается видео-регистратором, навигационной системой и, так необходимыми в такси – “таксометром” и радиостанцией, кроме того предполагается оснащение прибором для считывания пластиковых платёжных карт.



Отзывы

имя как должность — журнал За рулем

Презентация Lada Premier, удлиненной версии «десятки».

Знатокам отечественной техники представлять эту фирму нет необходимости: она известна удлиненной версией «десятки», получившей индекс «108» и собственное имя «Премьер». От типовой машины она отличалась прежде всего увеличенной на 175 мм базой, что обеспечивало комфорт расположившимся сзади пассажирам. Другое заметное отличие — более мощный и, что важнее, тяговитый 16-клапанный мотор объемом 1,8 л. Стоит отметить, что многие руководители АВТОВАЗа использовали в качестве служебной машины именно «Премьер».

В период смены модельного ряда, когда «Приора» вытеснила «десятку» с конвейера, в «Супер-Авто» сосредоточились на производстве двигателей, которыми уже сейчас можно оснастить обычные (со стандартной базой) седаны.

На заказ салон отделают под дерево.

На заказ салон отделают под дерево.

За блоком управления стеклами — оригинальная мультиплексная проводка.

За блоком управления стеклами — оригинальная мультиплексная проводка.

К сожалению, стойка на задней двери перекочевала с «Премьера» предыдущего поколения. Но иным способом затраты не минимизировать.

К сожалению, стойка на задней двери перекочевала с «Премьера» предыдущего поколения. Но иным способом затраты не минимизировать.

С силового агрегата, пожалуй, и начнем знакомство c новым «Премь­ером». Первые 1,8-литровые экземпляры строились на основе 1,5-литрового блока и при заявленной мощности 98 л.с. реально выдавали на 3–4 «лошади» больше. В новой версии объем мотора несколько уменьшили — до 1,75 л. Зато благодаря новой шатунно-поршневой группе удалось снизить потери на трение и увеличить отдачу без уменьшения ресурса, который официально заявлен на уровне 100–110 тыс. км пробега.

Впрочем, слабое звено в силовом агрегате не двигатель, а трансмиссия. Если проблему со сцеплением решить относительно просто — в стандарте устанавливается немецкое, марки LuK, то предел возможностей коробки давно выбран. Она попросту не в состоянии передать большой крутящий момент, поэтому конструкторы «Супер-Авто» остановились на 162 Н.м. Причем львиная доля его доступна в широком диапазоне оборотов.

Как и предыдущий, новый «Премьер» отличается от базовой модели длиной — плюс 175 мм. В увеличенных задних дверях разместились дополнительные секции окошек. Такое решение не назовешь дизайнерской находкой, но переход на новую конструкцию — цельное опускное стекло- неизбежно увеличил бы стоимость автомобиля.

Пока «Премьер», по сути, остается «Приорой» — чуть более мощной, комфортной и тщательнее собранной. В активе более богатая комплектация с оригинальными сиденьями, улучшенной шумоизоляцией, АBS и гидроусилителем рулевого управления. Это, кстати, привилегия и доведенных в «Супер-Авто» машин со стандартной базой. Но в перспективе, когда на «Премьере» появятся более современная ABS с распределением тормозных сил, контроль курсовой устойчивости и, главное, новый силовой агрегат, — автомобиль получит шанс занять свою, особую нишу.  

Концепция нового «Премьера» не изменилась: это удлиненный серийный седан в расширенной комплектации.

МОТОР НА ВЫРОСТ

Исчерпав возможности вазовских агрегатов, «Супер-Авто» планирует открыть собственный моторный цех. Предполагается, что новые двигатели с алюминиевым блоком будут иметь рабочий объем от 1,8 до 2,2 л, оригинальную головку цилиндров, непосредственный впрыск… На уровне современных иностранных моторов! Такие двигатели в форсированном варианте подойдут для спортивных модификаций. Но, к примеру, нынешний объем выпуска автомобилей «Супер-Авто» составляет около 2,5 тысячи в год (из них большая часть — «приоры» с двигателем 1,8 л, «премьеров» же выпустят около двух сотен). А линия по сборке новых моторов окупится при выпуске 5–10 тысяч в год. Значит, им найдется место и под капотом «Калины» и даже других марок.

Логично появление новой коробки передач. Для ее разработки привлекут специалистов — идеи, не нашедшие применения в условиях массового производства, можно осуществить силами смежной фирмы.

Единственное, что омрачает перспективу, — уже заключенное АВТОВАЗом соглашение о производстве двигателей «Рено».

Приора снята с производства, а также удлиненная Нива

Одни из самых известных моделей российского концерна «АвтоВАЗ» — Lada Priora и ВАЗ 2131 в удлиненном варианте в 2016 году перестанут выходить с конвейера. Руководство компании приняло официальное решение о прекращении выпуска моделей. На данный момент Lada Priora выпускают только после получения сформированного заказа, а производство обычной модели ВАЗ 2131 сокращено на тысячу экземпляров. По заявлению представителей «АвтоВАЗа», концерн направит свои силы на развитие более перспективных и популярных моделей.  

 «АвтоВАЗ» остается крупнейшим российским автоконцерном, чьи автомобили широко распространены не только в России, но в Восточной Европе. При этом озвученный на днях производственный план концерна на следующий год говорит о солидном сокращении модельного ряда автомобилей. По мнению автоэкспертов, тяжелая финансовая ситуация в стране, резкое сокращение потребительского спроса и нестабильная работа поставщиков запчастей стали решающими факторами того, что приора снята с производства во всех комплектациях. 

 Кроме прекращения выпуска некогда популярных моделей «АвтоВАЗа, будет сокращено производство Lada Kalina на 3000 экземпляров, Lada Largus почти на 6 000 автомобилей и Lada Vesta на 5 000 экземпляров. Также в 2016 году выпустят всего 20 000 внедорожников Lada XRay. Без изменений останется план выпуска Lada Granta – 43 000 машин. Выпуск моделей Datsun, созданных на платформе Lada Kalina, увеличится до 38 000 экземпляров. 

 При этом если Kalina и Largus успели заполонить авторынок, то Vesta только-только появится у официальных дилеров в ноябре текущего года. Что касается внедорожника XRay, то здесь на сокращении производства настояли французские коллеги из Renault. Дело в том, что российский внедорожник стоит дешевле и обладает лучшими характеристиками, чем аналогичные французские модели, а европейский автоконцерн весьма негативно относится к достойным конкурентам своей продукции.

 Стоит отметить, производственные трудности возникают и при выпуске моделей других автомобильных марок. Несвоевременная поставка необходимых запчастей для зеркал заднего вида заставила остановить 15 октября текущего года целую линию российского автоконцерна, выпускающую автомобили марки «Renault» и «Nissan». Производственный план 2016 года по выпуску Renault Sandero, Renault Logan и Nissan Almera также снижен на несколько тысяч экземпляров из-за нестабильной работы поставщиков комплектующих деталей.

— История — Компания — ГК »Супер-Авто»

1997

 

  Одним  из приоритетных  направлений  в  стратегии развития  ОАО «АВТОВАЗ» является создание на базе основного модельного ряда новых автомобильных модификаций различного назначения. В целях реализации  этого  направления  и  было принято решение о создании специализированных структурных  образований, работающих под эгидой ОАО «АВТОВАЗ».  Одним из таких структурных образований и является производственная компания «Супер-Авто», организованная 24 января 1997 года в Тольятти, и работающая в тесном сотрудничестве с  автозаводом.  В связи с этим 1997 году начинается разработка нескольких новых автомобилей:

 

 
 LADA 21106 — Кузов ВАЗ-21106 отличается от ВАЗ-2110 задними и передними крыльями с расширенными арками колес. Устанавливается двигатель Opel C 2.0 XE 16V мощностью 150 л.с.

 LADA 2120 — семиместный полноприводный минивэн, первым в истории российского автомобилестроения. Специально для него была разработана полноприводная удлинённая платформа на базе автомобиля «Нива».

 

LADA 21108 «Премьер»  — удлиненная на 175мм версия автомобиля LADA 110.

 

 

Все эти модели  являются результатом совместного проекта Департамента технического развития ОАО “АВТОВАЗ”  и  «Супер-Авто». Особый интерес вызвал автомобиль «Премьер».

 

1998

 

          Сборка  автомобилей LADA 21106 и LADA 2329 «Пикап». Активно ведутся работы по подготовке производства автомобиля LADA 21108 «Премьер».
       Являясь специализированным партнером ОАО «АВТОВАЗ», «Супер-Авто» быстро налаживает производство, соответствующее всем техническим требованиям и нормативам автозавода: на все автомобили, собранные “Супер-Авто» распространяются соответствующие гарантийные обязательства ВАЗа, они имеют заводской сертификат качества и полное право на послегарантийное обслуживание.

      “Супер-Авто” оказывает услуги ОПП и участвует в сборке автомобилей:

 

   ВАЗ 2131 — модификация внедорожника ВАЗ-21213, отличающаяся от базовой модели удлинённой на 500 мм колёсной базой и 5-дверным кузовом с дополнительной парой задних боковых дверей.

      ВАЗ 21312 — пятидверная нива с двигателем объемом 1,8 литра.

 

 

 

 

ВАЗ-2329 с открытой однобортовой грузовой платформой.

ВАЗ  2129 — пикап с двойной кабиной на базе удлиненного внедорожника

     

 

 

ВАЗ  2120   Надежда — семиместный полноприводный минивэн.

 

1999

Прекращается сборка автомобиля LADA 21106  в связи со спадом спроса на этот автомобиль. Сборка автомобиля LADA 2329 “Пикап” передается в ООО “Моторика”. Увеличивается производство автомобиля LADA “Премьер”.

 

 2000

Изготовлено и продано порядка 500 автомобилей LADA 21108 “Премьер”, что в 7 раз превышает объем продаж в предыдущем году. Все остальные автомобили перестали иметь предложение по продаже и реализации от ЗАО “Супер-Авто”.

 

 2001

В феврале «Супер-Авто» демонстрирует тольяттинцам перед  Дворцом  спорта

 » пассажировоз »  для  перевозки авиапассажиров.  Данный трансфер до сегодняшнего момента эксплуатируется аэропортом “Курумоч”.

 

 

 

 


2002

Начало сборки двигателя 21128 объемом 1.8L  в ОПП ОАО “АВТОВАЗ” под руководством инженерного состава ЗАО “Супер-Авто”.

 

 

 2003

 

Разработка автомобиля LADA 21128 Coupe Sport. Сборка тестового экземпляра. Активное участие в выставках и тест-драйвах автомобиля Coupe Sport.

 

 

 

 

 

 

 

2004

В конце сентября на предприятии был собран двухтысячный Lada 21108 «Премьер». С 1 ноября 2004г ЗАО «Супер-Авто» начало продажи автомобилей LADA 110  c 16-клапанным двигателем объемом 1,8 литра.

 

 2005

Основным видом продукции является производство автомобиля LADA 21108 «Премьер», LADA 110 с двигателем 21128 1,8L, LADA 112 с двигателем 21128 1,8L и  по заказу LADA 112 COUPE SPORT . На рынке автомобили производства «Супер-Авто» представлены в комплектации “Стандарт», «Норма» и «Люкс».

 

2006

Увеличение программы производства и расширение модельного ряда. Сборка и реализация  автомобилей LadaPremier, Lada 110 и  112 с двигателем 21128, производство автомобилей Lada 112 Coupe Sport. Ведется разработка автомобилей на базе новой модели ОАО  “АВТОВАЗ”  «Lada Priora».

В 2006 году началась деятельность по выполнению государственных заказов.

 

 2007

Снятие с производства  автомобилей LADA 110 1.8 и LADA 21108 Premier. Производство модели LADA 112 1.8 и LADA 112 Sport. Юбилейный выпуск 2000-го автомобиля  с двигателем 1,8л. Подготовка к производству автомобилей LADA 21703 1.8, LADA 21708 Premier и LADA 21723 1.8.

Приобретен обрабатывающий центр CHIRON MILL 2000 .

 

 2008

Снятие с производства  автомобилей LADA 112 1.8.

Подготовка производства для выпуска автомобилей LADA 144 16v и получение одобрения типа.

Начало производства автомобилей LADA 21708 Premier.

 

2009

Производство и реализация автомобилей LADA 144 16v. Подготовка производства для выпуска автомобилей        LADA 134 16v, LADA 154 16v  и получение одобрения типа.

 

Разработка автомобиля с пластиковым кузовом на рамной основе на базе автомобиля LADA 4×4 “Stalker”.

В связи с увеличением объема производства, вывод в отдельную организацию структуры, осуществляющую подготовку автомобилей по государственным и муниципальным заказам — ООО «Супер-Авто Холдинг».

 

2010

Налажено производство автомобиля семейства LADA Samara 2 с 16 клапанным двигателем (ВАЗ 21124, ВАЗ 21126). Ежемесячное производство автомобилей увеличилось до 400 штук в месяц.

Продолжается выпуск автомобилей LADA Priora Premier.

 

Разработка автомобиля Nika с пластиковым кузовом на рамной основе.

 

2011

1. В связи с увеличением сборки мелкосерийных автомобилей запланирована модернизация производства.

 2. В связи с организацией новых рабочих мест запланировано обучение новых сотрудников и повышение квалификации уже работающих.

 3. Увеличение программы сборки мелкосерийных автомобилей на базе машинокомплектов ОАО “АВТОВАЗ” в 2 раза по сравнению с 2010 годом.

 4. Возрождение производства специализированных автомобилей на базе серийной модели LADA 4×4. Переход мощностей ООО «Моторика» в ГК «Супер-Авто».

 5. Расширение географии продаж мелкосерийных автомобилей, в том числе реализация в странах ближнего зарубежья: Казахстан, Украина, Молдова, Болгария, Румыния,  Сербия, Венгрия.

 6. Участие в государственных контрактах совместно с ОАО “АВТОВАЗ”.

Группа компаний “Супер-Авто” зарекомендовала себя как надежный поставщик и ответственный исполнитель договорных отношений при выполнении государственных контрактов. В 2011 году планируется укрепление сотрудничества с такими государственными структурами, как МВД, МЧС, почта России,  здравоохранение.

  

Планируется разработка и внедрение конструктивных особенностей для различных моделей автомобилей LADA с целью расширения возможностей их  применения. 

 

 2012

1. В связи с увеличением плана сборки и продаж мелкосерийных автомобилей LADA произведена модернизация производства и увеличено число постов сборки.

 2. Проведено обучение новых сотрудников и повышение квалификации уже работающих.

 3. Увеличение программы сборки мелкосерийных автомобилей на базе машинокомплектов ОАО “АВТОВАЗ” в 1,5 раза по сравнению с 2011 годом.

 4. Модернизация производства специализированных автомобилей на базе серийной модели LADA 4×4.

 5. Расширение географии продаж мелкосерийных автомобилей, в том числе реализация в странах ближнего зарубежья: Казахстан, Украина, Молдова, Болгария, Румыния,  Сербия, Венгрия.

 6. Участие в государственных контрактах совместно с ОАО “АВТОВАЗ”.
 
7. Общее количество собранных за 2012 г. автомобилей — 14183 шт.  

7. Участие в выставочных мероприятиях в различных регионах России международного уровня.

8. Разработка и демонстрация а/м LADA Largus «Такси».

 

 

 

2013

1. Продолжение сборки автмообилей LADA Samara 2 с 16 клапанным двигателем, LADA 4×4 Пикап, LADA 4×4 Медицинский

 2. Получение Одобрения типа транспортного средства на автомобиль LADA PRIORA 1.8L

 

 

2014

1. Подготовка и реализация постановки на производство двигателей объемом 1.8 литра 

 2. Старт продаж автомобилей LADA PRIORA 1.8L

3. Исследовательские работы по автомобилю LADA 4×4 1.8L 

   

Метизы (болты, гайки, фиксаторы) для автомобиля

К сожалению, по вашему запросу ничего не найдено. Пожалуйста, убедитесь, что запрос введен корректно или переформулируйте его.

Пожалуйста, введите более двух символов

Все результаты поиска

Авто с префиксом «супер» | Русский Автомобиль

О том, что из обычной преднеприводной Лады можно сделать настоящий лимузин, мы узнали ещё в 1994 году, когда на одном из Автосалонов была показана удлинённая на полметра версия ВАЗ 21099 – Амадео 500 от тольяттинской фирмы Мастер-дизайн.

Фото украдено из интернета

Идея была смелой до нелепости, но… «Девяносто девятая» на роль базы для стретча годилась, мягко говоря, мало. Однако с появлением Амадео в общественном сознании что-то перещёлкнулось, стереотипы поколебались и рухнули. О лимузине на базе Лады думать стало можно. Оставалось дождаться только более подходящей базовой модели. Коей закономерно стала «Десятка», ВАЗ 2110.

Растянутая на 175 мм «Десятка» под названием ВАЗ 21108 – это то, с чего началась история тольяттинской фирмы Супер-Авто. Началась 24 января 1997 года, хотя что конкретно произошло в тот день, уже никто и не вспомнит. Тогда, в начале 1997-го, вице-президент ВАЗа по техническому развитию (и, по совместительству, друг Каданникова) Константин Сахаров договорился с руководством АвтоВАЗтехобслуживания на аренду одного из корпусов Автоцентра Тольятти-ВАЗ. Фирму решили назвать не без претензии – Супер-Авто, ведь делать хотели максимально престижные и дорогие модификации «Десятки». В списке основателей Супер-Авто можно найти бывшего директора ОПП Сергей Перевезенцева, главного ВАЗовского технолога Владимира Пересыпкинского, заведующего соцобеспечением ВАЗа Александра Пушкаря и будущего главного конструктора ВАЗа Владимира Губу. С фамилией последнего Супер-Авто ассоциируют до сих пор…

На сайте фирмы сказано, что первой машиной был не лимузин, а обычная «Десятка», только с «опелевским» 150-сильным мотором (ВАЗ 21106). Есть информация, что сделали так же несколько образцов пикапа из длиннобазной Нивы. Однако другими источниками это не подтверждается: 21106 и ВАЗ 2129 Пикап производила в те годы тольяттинская фирма Моторика.

Доподлинно известно, что в 1998-ом появился ВАЗ 21108 «Премьер» – тот самый стретч на платформе 2110. Ещё с простым 8-клапанным мотором.

Отмечу, что официальная история Супер-Авто, размещённая на сайте фирмы, изобилует двусмысленными пассажами: «специализированное структурное  образование, работающее под эгидой ОАО АвтоВАЗ», «специализированный партнёр ОАО АвтоВАЗ…» Этим, конечно, создатели фирмы подчёркивают близость к «головному» предприятию. Юридически же Супер-Авто никакого отношения к ВАЗу не имело и не имеет, это совершенно самостоятельное предприятие, ни дочерняя фирма, ни структурное подразделение (каковыми были, допустим, Бронто и ОПП). Хотя неформальные связи с ВАЗом у Супер-Авто покрепче, чем у иных «дочек»…

В 2004 году для ВАЗ 21108 разработали двигатель 21128 объёмом 1,8 и мощностью 105-107 л.с. Разумеется, на базе ВАЗовского, расточив его. Этот мотор собирали на ВАЗовском ОПП. Как рассказал директор Супер-Авто Алексей Родионов (а именно он десять лет назад занимался подготовкой производства), мотор получился хорошим, но… нестабильным. Были проблемы с хонинговкой блоков (это делал подрядчик), с качеством ШПГ. В итоге каждый мотор – лотерея, один мог пройти без капремонта 300 000 км, другой едва дотягивал до 30 00 км.

Алексей Родионов, генеральный директор Супер-авто. Начинал работать на фирме в 2001 году инженером по обеспечению

Поначалу длинных «Десяток» делали немного, несколько  десятков машин в месяц. Но даже такой объём был рентабельным, из-за высокой добавленной стоимости. ВАЗ 21108 оказался востребованным у ВАЗовского руководства, которому по служебным делам не пристало ездить на иномарках. А на стандартных ВАЗах ездить уже не хотелось. Даже сделали с помощью Бронто две бронированные машины с моторами Opel для Виталия Вильчика, тогдашнего директора ВАЗа. Эти машины, сменив несколько владельцев, живы и теперь, находятся в частных руках. Правда, броню с них давно сняли. К 2000 году производство «стовосьмых» подскочило до 500 штук и стало совсем хорошо, о прочих моделях на волне успеха на какое-то время забыли.

А вот настоящих лимузинов, с внутрисалонной перегородкой, Супер-Авто не выпускала никогда. Хотя в природе такие машины существовали – это была единичная продукция других тольяттинских фирм, например, Спецавто. Со Спецавто был у Супер-Авто и совместный проект – купе на базе «Десятки» (LADA 21128 Coupe Sport). Этих машин на обеих площадках изготовили, увы, немного, хотя машина получилась эффектная.

Фото Десятки-купе до сих пор висит в кабинете директора Супер-Авто

Конструкторы Супер-Авто тогда сделали переднюю подвеску на подрамнике, расширили колею, двигатель форсировали до 125 л.с… Но удалось собрать всего пять или шесть машин – на такой эксклюзив спрос оказался невысоким. Пришло время переориентироваться на что-то более массовое.

И таким продуктом оказались машины «десятого» семейства с двигателем 21128. На долгое время они стали визитной карточкой фирмы. А когда появилась Приора, то и под неё адаптировали 105-сильный двигатель, эта машина носила индекс 21703.

В середине двухтысячных годов году Супер-Авто выигрывает ряд тендеров и поставляет автомобили для госстуктур, прежде всего МВД и ФСИН. Госконтракты впредь станут хорошей поддержкой, но и поводом для череды мелких скандалов. Дескать, фирма умудряется выигрывать тендеры, предлагая отнюдь не самую низкую цену, на свободном рынке точно такие же машины продаются дешевле… Тогда у руля Супер-авто стоял сын Владимира Губы Антон, ставший де-факто (впрочем, и де-юре тоже) владельцем компании. Но в 2008 году он оставляет должность гендиректора и начинает развивать компанию с похожим названием – Супер-Авто Холдинг. Однако все мало-мальски значимые события на производстве по-прежнему находятся под его контролем.

Случались и слегка авантюрные проекты. Например, в 2007 году Супер-Авто совместно с фирмой Апал замыслила производить эрзац-внедорожник Сталкер с пластиковым кузовом.

Сталкер 2154 Фото украдено из интернета

Были сварены кондукторы, подготовлена закупка оборудования. Но наступил 2008 год – время, не очень, мягко говоря, подходившее для венчурных проектов. На рискованные инвестиции никто не решился и Сталкер на Супер-Авто делать не стали.

В разгар кризиса 2008 года фирме нужна была «спасательная» модель, заведомо востребованная. Подумав и посчитав, решили делать Самару-2 с двигателями от Приоры (21124 и 21126, 87 и 98 л.с соответственно). Это было рационально с точки зрения себестоимости (в машинах не применялось оригинальных деталей) и находилось в тренде тогдашнего спроса. Объём производства сразу взлетел с 200 до 600 штук в месяц! И пусть маржинальность мощных Самар была невелика, они позволили пройти фирме кризис 2008-2009 годов с относительно небольшими потерями. И даже создать материально-финансовый задел для будущих разработок.

Сборка ВАЗ 2114 Супер Авто

LADA 144 16v Супер-Авто выпускает и сейчас, она пользуется спросом у молодёжи. Но, понятно, дни её сочтены: ВАЗ только что отрапортовал о прекращении производства 2114, товарных запасов хватит ненадолго.

Ещё Супер-Авто делает пикапы на базе длинной Нивы/Лады 4х4 и спецавтомобили — санитарный, полицейский, спасательный. Это наследство от обанкротившейся в 2011 году фирмы Моторика, у которой выкупили оригинальную производственную оснастку. Поначалу такие машины собирали прямо в цехе бывшей Моторики, но он отошёл кредиторам за долги и оборудование перенесли на основную площадку.

Специальные машины делаются по конкретным заказам и в результате выигранных тендеров. Например, в конце сентября Супер-Авто получила контракт на 30 санитарных автомобилей для Челябинской области. В среднем по году таких машин производится 30-40.

Проект такси на базе Ларгуса, показанный на Автосалоне 2012 года

Давайте посмотрим, как работает сборочное производство Супер-Авто

Весь завод – это один большой цех, разделённый на две части. Даже на три, если считать маленький участок сборки пикапов.

Кузова 2114 с ВАЗа приходят в так называемой «первой комплектации», их ещё называют «кузова обитые в сборе».  Фактически это автомобили без силового агрегата и элементов шасси, с почти полностью собранным салоном.

Кузова ставят на технологические тележки с колёсиками, на них машина будет перемещаться до тех пор, пока не «обрастёт» собственными колёсами. До поры она будет стоять в небольшом накопителе, в самой левой части цеха.

Первая операция – набитие VIN-а. Супер-Авто имеет свой код производителя и набивает оригинальный VIN параллельно ВАЗовскому. В ПТС записываются оба.

Потом на семи постах дособирают салон – крепят «приборку», рулевую колонку с рейкой (стандартной, к сожалению, хотя могли бы уже ставить и «короткую»), кое-что доделывают в интерьере. Меняют электропроводку под шестнадцатиклапанный двигатель (там другой жгут замка зажигания). «Торпедо» приходится снимать. На все эти операции уходит 4,5 часа.

Ставят и тюнинговые распорки между чашками передних амортизаторов:

Среди обилия «четырнадцатых» вижу кузов белой Приоры и спрашиваю Родионова: что, готовитесь? Тот отвечает уклончиво: это я вам потом расскажу…

Переходим в другую часть цеха, где, как говорится, «делают механику». То есть превращают кузов в автомобиль.

С тележки машина перемещается на подъёмник

На двенадцати двустоечных подъёмниках к машинам прилаживают силовые агрегаты, подвески, тормоза, колёса. Это даже не стапельная сборка получается, а просто сборка: одна машина – один пост. В большинстве случаев «механикой» заведует один мастер, универсальный, способный и тормозные трубки проложить, и двигатель к электропроводке подключить. На все операции ему даётся чуть больше семи часов.

LADA 144 16v отличается от «просто четырнадцатой» рядом узлов. Например, задняя балка, передние стойки, приводы колёс – это всё «приоровское». Относительно 2114 вырос клиренс, на 30 мм. ВАЗ, между прочим, все эти переделки официально одобрил. «Сточетырнадцатая» получилась тяжелее 2114, но легче Приоры. Поэтому и динамичнее.

Защита ЛКП не тотальна, но всё же присутствует, в обязательном порядке надеваются защитные накидки на переднюю панель и передние крылья.

Отдельным участком собирают силовые агрегаты, стыкуя коробку с двигателем:

Силовой агрегат подаётся к каждому подъёмнику на оригинальной тележке…

…и уже здесь ему вставляют приводы колёс:

После того, как машина собрана, её снимают с подъёмника и закатывают на один из двух стендов регулировки углов установки колёс:

Стенды отличные, современные, не хуже ВАЗовских.

Проверяют машины и на герметичность в дождевальной камере:

Потом – дорожные испытания, которым подвергаются абсолютно все автомобили. Это 30 км своим ходом плюс проверка тормозов на стенде. Проблемы, выявляемые на обкатке, устраняют на участке доводки. Без работы ребята с этого участка явно не сидят…

Процесс сборки одного автомобиля от разгрузки кузова до подписания всех бумаг занимает 14,5 часов. Две рабочие смены, короче. Сам завод работает без выходных, а рабочий день длится 11 часов. Две бригады по 30 человек работают по схеме «два через два».

В дальнем углу цеха стоит большой пятикоординатный станок для мехобработки CHIRON MILL 2000, которым в Супер-Авто гордятся: дорогой, говорят, миллион долларов, всё что угодно на нём можно сделать.

Покупали станок в расчёте на изготовление блока цилиндров своего двигателя. Но в кризисном 2008 году проект двигателя пришлось притормозить…

Сейчас на этом станке… не делают ничего. Но идёт подготовка к производству лопаток высоконагруженных газовых турбин. К автопрому это не имеет никакого отношения, заказчик на эти лопатки совсем другой, из химической промышленности.

Пикапы – это прямо противоположный участок производства.

Голые загрунтованные кузова получают из ОПП, другой подрядчик их красит.

Почему не красят прямо в ОПП? – спрашиваю. А договорится пока не можем, — отвечают, — Хотя ОПП буквально в двух шагах, через забор. У них покрасочная линия – узкое место, едва-едва справляются со своей продукцией…

По ВАЗовской технологии многие швы обрабатываются антикором

Первым делом в окрашенный кузов монтируют детали салона.

Потом машину перемещают с тележки на подъёмник для установки «механики».

Подвозят на тележках силовой агрегат в сборе с передней подвеской, мосты…

Всего на Ниву работают четыре подъёмника – это штучное производство, хэнд-мейд.  От 40 до 60 в месяц, то есть в лучшем случае пара машин в день.

В грузовой отсек укладывают полиэтиленовое защитное «корыто» толщиной 4 мм:

Далее – тент, который бывает двух видов, высокий и низкий.

Бывают заказы и на «чистый» пикап, без тента.

А это готовая крыша для санитарной версии Нивы.

Всё, автомобиль собран, теперь обязательные сход-развал, тормозные барабаны и тридцатикилометровая обкатка.

Что дальше?

Всё это прекрасно, Самара с мощным мотором, Нива-пикап… Но эти модели безнадёжно отстали от прогресса. Даже если на них сейчас есть спрос, это не значит, что он будет и завтра. Самару ВАЗ вообще снял с производства. А ведь LADA 144 16v до последних дней была основой производственной программы Супер-авто! Что же теперь будет делать фирма, без своего базового продукта? Что станет выпускать, когда иссякнет поток «четырнадцатых»?

Первое время планируют перебиваться на пикапах и возможных заказах на спецмашины.

А потом – Приора. Не зря Родионов лукаво улыбался: Приору уже «прогоняют» по всему технологическому циклу, смотрят, что надо изменить.

Разумеется, это будет не стандартная Приора, а более мощная. Супер-Авто планирует вернуться к мотору 1,8, только теперь уже мощностью 123 л.с. Говорят, это новая разработка, а не модернизация прежнего двигателя 21128. Хотя не исключено, что нести он будет тот же индекс. Сама же Приора от Супер-Авто будет именоваться 21703-28.

Увеличенный рабочий объём получили без расточки 126-го блока. В этом моторе применены новые распредвалы, с увеличенным «подъёмом» (до 8,5), а степень сжатия понижена на полединицы. Это не только делает двигатель более детонационно-стойким, но и выравнивает характеристику крутящего момента. На оборотах 2200 он выдаёт 145 н.м, а на 4000 – 165 н.м. Что, как видим, на пределе возможностей коробки передач. Конечно, это не может не сказаться на её ресурсе, увы… Приора с новым двигателем работает чуть громче, хотя в ГОСТ по шуму вписывается. Во всяком случае у сертификационных испытателей претензий по этой части не возникло. ОТТС планируют получить со дня на день, до конца этого года.

Стоит такая машина будет на 25-30 тыс дороже Приоры с двигателем 21126.

В процесс сборки тоже вносятся изменения. Постепенно Супер-Авто движется к созданию собственного конвейера. Его подобие организуют уже в начале будущего года. Там по направляющим вручную станут передвигать машины от поста к посту. Это связано с тем, что Приору ВАЗ не может выпускать в «первой комплектации», придётся брать голый окрашенный кузов и собирать машину полностью, как это делается на Ладе Спорт. Соответственно, добавляется девять постов миниконвейера. А в перспективе установят и механический напольный конвейер, с ним, по словам Родионова, рентабельно работать при объёме от 650 машин в месяц. LADA 144 16v, кстати, выпускалась не намного меньшим тиражом. Но с Приорой, машиной более дорогой, таких показателей сразу не ждут, выйти бы на 300.

Вы таки будете смеяться, но длиннобазную Приору с производства не сняли, просто на неё сейчас нет заказов. Последние машины сделали в 2012-ом, 16 штук, для руководства ВАЗа, оснастив их модернизированной версией старого двигателя 1,8. Сейчас такие моторы собрать уже не смогут. Но ведь скоро появится более совершенный! Значит, для модели 21708 ещё не всё потеряно.

А дальше… Дальше Супер-Авто хочет делать мощную версию Гранты. Но если по Приоре у ВАЗа особых возражений нет, то Гранта 1,8 напрямую станет конкурировать с ВАЗовской Грантой Спорт. Видимо поэтому с заводом на поставку машинокомплектов договориться не удаётся. Хотя проект полностью готов к воплощению. Вот как выглядит Гранта в варианте Супер-авто:

Как видим, не только мотором примечательна эта машина. Эффектный обвес сделал штатный дизайнер Супер-Авто (бывший ВАЗовский, разумеется), он же облагородил салон вставками под алюминий и красивой прострочкой в обшивке кресел. Передние сиденья будут спортивными, даже более спортивными, чем на Гранте Спорт.

Поисковые эскизы для спортивной Гранты

Стоить такая Гранта должна на 7% дороже ВАЗовской, то есть, опять же, как и ГС. Правда, у неё немного другая идеология: только мощность, никаких переделок шасси. Вот её характеристики, взятые из презентационного буклета:

Получится ли?

Сейчас Супер-Авто способна делать до 15000 автомобилей в год. Только Приорой и пикапами этот ресурс не выбрать. Гранта была бы ну очень кстати! Увы, продавать её в любом случае придётся самостоятельно: войдя в сбытовую сеть ВАЗа несколько лет назад, Супер-Авто не конкурировала с базовыми моделями, а теперь у завода есть похожая продукция. Зная жёсткий характер вице-президента ВАЗа по маркетингу Артёма Федосова, я почти уверен, что он Гранту от Супер-Авто в ВАЗовский сбыт не пустит.

Но на ВАЗе, как известно, грядут большие перемены…

Нравится(7)Не нравится(0)



При использовании материала, пожалуйста, сделайте ссылку на Русский автомобиль.

Синдром Игла, удлиненный шиловидный отросток и новые данные о предварительных мерах предосторожности при потенциальной дисфункции шейных артерий

Андреа Вестбрук сертифицирована по ортопедической мануальной терапии и является членом AAOMPT. Она работает врачом, работающим на полную ставку, и занимается преимущественно лечением пациентов с хроническими заболеваниями позвоночника. У нее были симптомы синдрома Орла, и она смогла определить диагноз после обширных исследований и найти облегчение своих симптомов с помощью шиловидэктомии. Она смогла проверить удлиненные шиловидные отростки у более чем 20 пациентов с неподатливыми шейными и головными симптомами и помочь им в их направлении к ЛОР-специалистам для надлежащей оценки и лечения после ограниченных устойчивых преимуществ вмешательств ПК.Она была соавтором и представила плакат о синдроме Орла в 2019 году на AAOMPT.

Винсент Дж. Каббаз — магистр манипулятивной физиотерапии и научный сотрудник AAOMPT. Он получил степень магистра манипулятивной физиотерапии и степень бакалавра прикладных наук в области физиотерапии в Университете Южной Австралии. Он — инструктор-стипендиат, преподающий передовую мануальную терапию и оценку манипуляций и методы лечения, включая меры предосторожности и противопоказания при дисфункции шейных артерий.Он владеет лечебной физкультурой HEAL, специализирующейся на нервно-мышечно-скелетных заболеваниях, и обнаружил удлиненный шиловидный отросток во время рутинной оценки шеи Андреа во время ее стажировки. Винс является соавтором публикаций по болям в пояснице и шее, манипуляциям с уколами, синдрому Орла и представлен на национальных конференциях и в Бейруте.

Кристофер Шоуолтер — доктор физиотерапии, сертифицированный ортопедический специалист и научный сотрудник AAOMPT. Он является директором программы стипендии по ортопедической мануальной физиотерапии (MAPS) Мейтленд-Австралийских семинаров по физиотерапии, аккредитованной Американской академией ортопедических мануальных физиотерапевтов (AAOMPT).Доктор Вестбрук завершил это исследование как частичное выполнение исследовательского компонента стипендии MAPS. Доктор Шоуолтер консультировал этот проект с самого начала.

© 2020 Elsevier Ltd. Все права защищены.

Продолжительный митоз приводит к структурно аберрантным и чрезмерно удлиненным центриолям | Журнал клеточной биологии

Центриоли представляют собой точно построенные структуры на основе микротрубочек, которые собирают центросомы и реснички. Аберрации в структуре центриолей обычны в опухолях, но как возникают эти аберрации, неизвестно.Анализ структуры центриоли затруднен, поскольку требует сложной электронной микроскопии. Здесь мы используем микроскопию расширения для изучения происхождения структурных аберраций центриолей в больших популяциях клеток человека. Мы обнаружили, что центриоли не имеют механизма мониторинга удлинения, который делает их склонными к чрезмерному удлинению, особенно во время длительного митоза, вызванного различными факторами, в том числе избыточными центриолями. Мы определили, что чрезмерное удлинение митотических центриолей зависит от митотической поло-подобной киназы 1, которую мы обнаружили как новый регулятор удлинения центриолей в велосипедных клетках человека.В то время как недостаточные уровни Plk1 приводят к образованию более коротких центриолей, лишенных полного набора триплетов микротрубочек, его сверхактивность приводит к чрезмерно удлиненным и структурно аберрантным центриолям. Наши данные помогают объяснить происхождение структурно аберрантных центриолей и почему в опухолях сосуществуют числовые и структурные дефекты центриолей.

Центриоли состоят из микротрубочек (МТ), собранных в девятичастный симметричный цилиндр (Воробьев, Ченцов, 1982).У млекопитающих длина центриолей составляет около 450 нм. Их проксимальный конец является местом скопления белкового материала, называемого перицентриолярным материалом, и местом удвоения центриолей. На дистальном конце расположены субдистальные и дистальные придатки, которые закрепляют MTs и образуют реснички и жгутики, соответственно. Новые центриоли (процентриоли) строятся перпендикулярно и примыкают к стенке существующих (материнских) центриолей в ранней S-фазе. После инициации процентриоли удлиняют свои МТ до тех пор, пока не достигнут длины материнской центриоли.В отличие от цитоплазматических МТ, которые являются динамическими, центриольные МТ растут очень медленно, стабильны и передаются новым поколениям клеток. Центросомные белки, такие как центросомный белок 4.1-ассоциированный белок (CPAP; Kohlmaier et al., 2009; Schmidt et al., 2009; Tang et al., 2009), Cep120 (Lin et al., 2013b; Mahjoub et al., 2010 ), центробин, Cep135 (Gudi et al., 2015; Lin et al., 2013a) и SPICE (Comartin et al., 2013) необходимы для удлинения центриоли. Однако, как регулируется удлинение центриолей человека на протяжении клеточного цикла, все еще неясно.

Структурные аберрации центриолей, включая чрезмерное удлинение, хорошо известны в опухолях (Chan, 2011). Их можно наблюдать уже в предопухолевых поражениях и они присутствуют почти во всех агрессивных опухолях (D’Assoro et al., 2002; Gönczy, 2015; Nigg and Raff, 2009). Структурно аберрантные центриоли нарушают архитектуру ткани и способствуют нестабильности хромосом (Ganem et al., 2009) и инвазивным свойствам клеток (Godinho et al., 2014; Nigg et al., 2017). Чрезмерно удлиненные центриоли чрезмерно накапливают перицентриолярный материал, нарушая симметрию митотических веретен. Они также могут вносить вклад в амплификацию центросом посредством фрагментации или образования множественных процентриолей вдоль своих удлиненных стенок (Kohlmaier et al., 2009; Marteil et al., 2018). Однако мало что известно о происхождении структурных дефектов центриолей в опухолях, и неясно, в какой степени клетки могут переносить вариации длины центриоли без вредных последствий.

Центриоли имеют субдифракционные размеры, поэтому для анализа центриолярных структурных характеристик требуются методы визуализации с высоким разрешением, которые трудоемки и не подходят для рутинного сбора больших наборов данных, что позволяет проводить строгий статистический анализ. Здесь мы используем адаптированный метод микроскопии расширения, который позволяет анализировать структурные особенности центриолей в больших популяциях клеток с помощью традиционной микроскопии.Мы применили этот метод в сочетании с электронной микроскопией и микроскопией сверхвысокого разрешения, чтобы изучить механизмы, которые приводят к образованию структурно аберрантных центриолей, наблюдаемых в опухолевых клетках.

Для определения длины центриоли в больших популяциях культивируемых клеток мы использовали экспансионную микроскопию, недавно разработанный подход к визуализации, который позволяет анализировать субразрешающие структуры с помощью обычных оптических микроскопов (Chen et al., 2015; Гамбаротто и др., 2019; Герцема и Эверс, 2016; Wassie et al., 2019). Мы адаптировали оригинальный метод экспансионной микроскопии «увеличенный анализ протеома» (Ku et al., 2016) для анализа длины центриоли, возраста и ресничек (Fig. 1 A; Sahabandu et al., 2019). Наш метод основан на том факте, что центриольные МТ повсеместно ацетилируются и могут быть надежно помечены в фиксированных клетках млекопитающих с использованием обычных антител против ацетилированного тубулина. Увеличение оптического разрешения, достигаемое за счет четырехкратного изотропного расширения, позволило нам изучить удлинение центриолей в зависимости от клеточного цикла.Кроме того, после экспансии можно четко выделить три поколения центриолей. Старые материнские центриоли можно отличить от более молодых центриолей по присутствию придатковых белков, таких как Cep164, а процентриоли можно отличить от материнских центриолей на основании их ортогональной ориентации по отношению к их материнским центриолям (Fig. 1 A).

Сначала мы решили определить постоянство длины центриолей путем измерения длины материнских центриолей в обычно используемых линиях клеток человека HeLa, RPE-1 и U2OS (рис.1 Б). Мы обнаружили, что материнские центриоли демонстрируют значительную вариабельность длины в каждом типе клеток, даже в нетрансформированных клетках RPE-1 (рис. 1B), с измеренными значениями в диапазоне от минимального экстремума ~ 300 до максимума ~ 500 нм. Эта изменчивость также была очевидна, когда более старые материнские центриоли (с придатками) анализировались отдельно (Рис. 1 B). Хотя более молодые матери в среднем были короче, они могли превышать длину центриолей старших матерей. Более подробный анализ, специфичный для клеточного цикла, показал, что средняя длина молодых материнских центриолей немного увеличивается между фазой G1 и митозом (рис.1 C), что означает, что в клетках HeLa удлинение более молодых материнских центриолей продолжается во время их второго клеточного цикла. Наши результаты с использованием экспансионной микроскопии аналогичны предыдущим исследованиям центриолей, выделенных из лимфобластных клеток человека (Chrétien et al., 1997).

Далее, разделение центриолей на проксимальную и дистальную части у основания субдистальных придатков показало, что обе части могут иметь переменную длину (рис.1 D). Основываясь на низкой частоте дефектов сегрегации веретена и хромосом в этих культурах, отсутствии ошибок дупликации центриолей и способности центриолей переменной длины собирать реснички (рис. 1 E), мы пришли к выводу, что обнаруженная вариабельность длины должна быть в пределах физиологических границ и несущественны для функций центриоли и центросомы. Эти результаты свидетельствуют о том, что циклические клетки человека не имеют строгого механизма мониторинга удлинения центриолей, который обеспечивает образование центриолей определенной длины.В отсутствие такого механизма следует ожидать образования центриолей непостоянного размера и, в некоторой степени, переносимого клетками, что согласуется с нашими наблюдениями. Мы предположили, что без механизма контроля длины центриолей, центриоли, особенно процентриоли, склонны к чрезмерному удлинению за пределы своего физиологически допустимого диапазона.

Чтобы проверить эту гипотезу и определить потенциальные факторы, которые приводят к чрезмерному удлинению, мы проанализировали динамику удлинения центриоли при различных возмущениях клеточного цикла.Сначала мы определили динамику удлинения процентриолей в невозмущенных циклических клетках. ЭМ-анализ процентриолей клеток HeLa показал, что от начала в S-фазе до раннего митоза они удлиняются до 290 ± 39 нм. Далее они удлиняются до 335 ± 25 нм за счет прометафазы / метафазы и до 380 ± 25 нм за счет телофазы / раннего G1 (рис. 2 A). Эти центриоли (далее называемые более молодыми материнскими центриолями), по-видимому, не удлинялись дальше в течение первых 3 часов G1 (рис. 2А, правая панель). Таким образом, динамика удлинения процентриолей меняется в течение клеточного цикла.Во время фазы S и G2 процентриоли удлиняются на ~ 290 нм за ~ 10 ч (0,5 нм / мин), тогда как между профазой и телофазой они удлиняются еще на ~ 100 нм всего за ~ 50 мин (2 нм / мин). Параллельно с этим более молодые материнские центриоли лишь немного удлиняются во время своего второго клеточного цикла, тогда как биохимически зрелые материнские центриоли сохраняют свою ранее установленную длину. Таким образом, в нормальных условиях клеточного цикла способность центриолей реагировать на стимулы удлинения обратно пропорциональна их статусу созревания.

Затем мы проанализировали, удлиняются ли центриоли чрезмерно во время остановки прогрессирования клеточного цикла. Чтобы задержать клетки в S-фазе, мы собрали митотические клетки путем встряхивания, переселили их и обработали гидроксимочевиной через 2 часа. В этих условиях материнские центриоли инициируют дупликацию примерно через 9–10 часов после встряхивания и после этого остаются задержанными в ранней S фазе из-за гидроксимочевины. Клетки фиксировали и увеличивали через 15 и 30 часов после встряхивания (что соответствует ~ 5 и ~ 20 часам остановки).Измерения длины сигналов процентриола ацетилированного тубулина показали, что во время остановки S фазы процентриоли не удлиняются чрезмерно (рис. 2, B и F). Этот результат согласуется с ЭМ-анализом, который показал процентриоли длиной ~ 190 нм в 30-часовой временной точке (рис. 2С) и предыдущими сообщениями (Курияма и Борисы, 1981; Шукла и др., 2015). Стоит отметить, что использование ацетилированного тубулина для определения длины процентриолей может немного занижать их длину, поскольку МТ процентриолей ацетилируются постепенно с проксимальных концов (рис.S1; Сахабанду и др., 2019). Затем мы проверили, не слишком ли удлиняются центриоли во время ареста G2. Клетки обрабатывали ингибитором Cdk1 / циклина B RO 3306 от G1. Такие культуры достигли G2 ~ 27 часов после встряхивания (Loncarek et al., 2010) и были инкубированы до 36 или 52 часов после встряхивания (что соответствует ~ 9 или 25 часам остановки G2), когда они были зафиксированы и расширен. В клетках, арестованных в конце G2, процентриоли удлиняются до ~ 400 нм (Fig. 2, D and F; Shukla et al., 2015), что превышает длину контрольных процентриолей в G2.

Чтобы остановить митоз клеток, логарифмически растущие культуры обрабатывали ингибитором Eg5, монастролом. Митотические клетки собирали через 1 час и инкубировали еще 3 часа, фиксировали и анализировали путем размножения. Анализ выявил сильно удлиненные процентриоли (рис. 2, E и F). В клетках HeLa в течение ~ 3 часов после остановки митоза средняя длина процентриолей превышала длину материнских центриолей.Большинство центриолей удлинялись со скоростью, аналогичной контрольным процентриолям в митозе (~ 2 нм / мин; рис. 2 A). Однако некоторые процентриоли увеличивали длину ≥700 нм в течение первых 3 часов остановки митоза, что означает, что они удлинялись быстрее (~ 3,9 нм / мин), чем контрольные процентриоли. Нередко было обнаружение двух процентриолей разной длины в одной камере во время ареста. Этот случай стохастического удлинения может означать разницу в локальной концентрации факторов удлинения. Элонгация процентриолей выходит на плато после ∼6 ч остановки митоза (рис.2 G), возможно, из-за исчерпания короткоживущих белков, необходимых для удлинения. Интенсивность ацетилированного сигнала была ниже по направлению к дистальным концам удлиненных процентриолей, которые были связаны с дистальным белком центриоли Cep290 (рис. 2 H). EM анализ подтвердил, что удлиненные сигналы ацетилированного тубулина представляют собой истинные центриоли (Fig. 2 I). Чрезмерное удлинение процентриолей во время остановки митоза происходит во многих клеточных линиях (Fig. 2 J). Однако процент клеток, образующих чрезмерно удлиненные и структурно аномальные процентриоли, варьировался между клеточными линиями (рис.2 Дж). Пока не ясно, что вызывает эту изменчивость.

Иногда материнские центриоли чрезмерно удлиняются во время длительного митоза. Однако средняя длина материнских центриолей увеличивается лишь незначительно во время любого ареста (Fig. 2 F), указывая тем самым, что механизмы, которые сдерживают дальнейшее удлинение материнских центриолей, остаются активными в этих условиях.

Чрезмерное удлинение процентриолей подтвердило, что клетки лишены механизма мониторинга удлинения центриолей и что процентриоли специфически склонны к избыточному удлинению, особенно во время митоза.Важность этого открытия состоит в том, что любое событие, ведущее к задержке митоза, может потенциально способствовать чрезмерному удлинению центриолей. Чтобы проверить эту идею, мы индуцировали образование множественных процентриолей с помощью временной обработки центриноном B, ингибитором киназы Plk4 (Wong et al., 2015; Fig. 3 A). Такие процентриоли формируют множественные центросомы в последующем клеточном цикле, что приводит к образованию мультиполярных веретен, задерживая выход из митоза из-за неудовлетворенной митотической контрольной точки (Fig. 3, A – C).Анализ мультиполярных митотических клеток, отложенных в митозе на 2–3 часа, показал, что они действительно несут чрезмерно удлиненные процентриоли, длина которых превышает длину материнских центриолей (рис. 3, D и E).

Предыдущие исследования продемонстрировали, что чрезмерно удлиненные центриоли могут приводить к амплификации центросом (Kohlmaier et al., 2009; Marteil et al., 2018). Здесь мы впервые устанавливаем, что обратное возможно и что числовые ошибки центриолей могут непосредственно спровоцировать структурные аберрации центриолей.Численные ошибки центросом могут возникать из-за прерванного митоза, из-за слияния клеток или из-за амплификации центриолей. Наши данные предполагают, что все эти события могут способствовать формированию центриолярных структурных аберраций. Это может объяснить происхождение аберрантно структурированных центриолей в опухолях и почему дефекты центриолярной структуры часто обнаруживаются в опухолевых клетках наряду с числовыми дефектами. Насколько нам известно, это первый отчет, показывающий, как чрезмерное удлинение центриолей может происходить в клетках без химических или генетических манипуляций с центросомными белками.Кроме того, наши данные показывают, что любое возмущение, ведущее к длительной остановке митоза, может приводить к чрезмерно удлиненным центриолям.

Чтобы понять судьбу чрезмерно удлиненных процентриолей, монастрол был вымыт через 3 часа остановки митоза, чтобы обеспечить выход из митоза. Клетки фиксировали через 3 и 24 часа и анализировали с помощью размножения и ЭМ. Иммуномечение ацетилированного тубулина и Cep290 показало, что чрезмерно удлиненные центриоли оставались в популяции после митоза (рис.3, F и G; и рис. S2). Они казались стабильными и могли дублироваться и образовывать митотические веретена, указывая на то, что их проксимальные концы были функциональными. Однако их дистальные концы характеризовались неравномерным сигналом ацетилированного тубулина, украшенным беспорядочно расположенным Cep290 (рис. 3, F и G). EM-анализ (рис. 3 F и рис. S2 A) выявил центриоли с аберрантными дистальными концами и удлиненными синглетами, дублетами или триплетами МТ. Аномальные центриолярные фенотипы, обнаруженные в популяциях клеток, подвергшихся митотической остановке, напоминали центриоли, обнаруженные в клетках MDA-MB-435, происходящих из меланомы, 40% из которых, как было показано, несут чрезмерно удлиненные и структурно аномальные центриоли (рис.S2 C; Marteil et al., 2018).

Чтобы понять, влияют ли обнаруженные дефекты на дистальных концах центриолей на реснички, мы использовали клетки mIMCD3, которые формируют реснички в присутствии сыворотки, и клетки RPE-1, которые формируют реснички при голодании сыворотки. Клетки фиксировали через 48 часов после выхода из продолжительного митоза, что позволяло чрезмерно удлиненным процентриолям созреть и сформировать реснички. В контрольных клетках около 80% зрелых центриолей образовали аксонемы ресничек различной длины, которые были связаны с цилиарным компонентом ARL13B (рис.3 H). Анализ культур через 48 часов после продолжительного митоза показал, что центриоли, имеющие структурно неповрежденный вид, образуют аксонемы, ассоциированные с ARL13B (рис. 3 H). Центриоли с чрезмерно удлиненным, но неравномерным ацетилированным сигналом на их дистальных концах лишены или имеют ослабленный сигнал ARL13B (рис. 3 H). Кроме того, аберрантные центриоли обнаруживают уменьшенную локализацию белка дистального придатка Cep164 (Fig. 3 H). Из 25 клеток mIMCD3, проанализированных с помощью ЭМ, в 2 были обнаружены центриоли с аберрантной структурой (что согласуется с низкой частотой чрезмерно удлиненных центриолей в этой клеточной линии, наблюдаемой при экспансии; рис.2 Дж). Обе аберрантные центриоли были связаны с цилиарными пузырьками, но их протяженные МТ были внутриклеточными и лишены цилиарной мембраны, что позволяет предположить, что ресничка была инициирована, но рост цилиарной мембраны был нарушен (рис. 3 I), что согласуется с отсутствием белка, ассоциированного с цилиарной мембраной. ARL13B вокруг протяженных центриолей MTs обнаружен с расширением (рис. 3 H). О подобном дефекте роста цилиарной мембраны сообщалось в фибробластах, полученных от пациентов, несущих мутацию Cep290 (Shimada et al., 2017). В 23 клетках, содержащих неповрежденные на вид центриоли (обнаруженные на разных стадиях ресничек в пределах одной и той же клеточной популяции) и в 6 контрольных ресничных центриолях mIMCD3, аксонемные MTs никогда не были обнаружены вне цилиарных пузырьков или лишенных цилиарных мембран. Эти данные указывают на то, что чрезмерно удлиненные центриоли, образующиеся во время длительного митоза, обладают нарушенной способностью формировать реснички.

Представление о том, что процентриоли не продолжают удлинение, если ранняя S-фаза продлевается, но чрезмерно удлиняются, если клетки задерживаются в G2 или в митозе, указывает на присутствие специфичного для клеточного цикла регулятора, который способствует удлинению центриолей на более поздних фазах клеточный цикл.Мы обратили внимание на Polo-подобную киназу (Plk) 1, которая, как было показано, связана с фактором удлинения центриолей CPAP (Firat-Karalar et al., 2014; Novak et al., 2016) и чья активность достигает пиков в G2 и митоз (Martin, Strebhardt, 2006), совпадающий с удлинением дистальных концов процентриолей. Чтобы изучить потенциальную роль Plk1 в чрезмерном удлинении процентриолей, мы собрали клетки, недавно задержанные в митозе с помощью монастрола, обработали их ингибитором Plk1 BI2536, инкубировали их в течение дополнительных 3 часов и увеличили их для анализа длины центриоли.В самом деле, ингибирование Plk1 во время остановки митоза предотвращает чрезмерное удлинение процентриолей (Fig. 4 A). Ингибирование одного только Plk1 приводит к остановке прометафазы. В таких клетках с задержкой прометафазы процентриоли также не удлиняются чрезмерно (рис. 4, B и C). В более высоких концентрациях BI2536 также ингибирует Plk2 (Steegmaier et al., 2007), который ранее участвовал в инициации и удлинении центриолей (Chang et al., 2010). Итак, мы дополнительно использовали более специфический ингибитор Plk1, GSK461364 (GSK; Gilmartin et al., 2009) и повторили эксперимент с самой низкой концентрацией BI2536, которая, как мы обнаружили, предотвращает выход из митоза клеток HeLa (80 нМ). Оба лечения блокировали чрезмерное удлинение процентриолей во время митоза, что определяется расстоянием между проксимальным концом ацетилированного тубулина и сигналами Cep290 (Fig. 4, D-G).

Для дальнейшей оценки того, может ли Plk1 стимулировать удлинение процентриолей в интерфазе, мы экспрессировали активный Plk1 (несущий активацию мутации 210TD, Plk1TD) в заблокированных в S фазе клетках HeLa, которые характеризуются более низкой активностью эндогенного Plk1, чем митотические клетки.Экспрессия Plk1TD действительно приводит к удлинению процентриолей за пределы их длины S фазы (Fig. 4H). Соответственно, избыточная экспрессия Plk1TD в циклических клетках увеличивает среднюю длину материнских центриолей (Fig. 5 A). EM анализ показал, что такие удлиненные центриоли имели более длинные, чем в среднем, проксимальные или дистальные концы и неправильно расположенные придатки (Рис. 5 B).

Чтобы понять, важен ли эндогенный Plk1 для образования правильно структурированных центриолей в интерфазе, мы ингибировали Plk1 из G1 или ранней S фазы, позволили клеткам перейти в профазу / митоз (~ 21 ч после встряхивания), зафиксировали их и проанализировали процентриоли путем расширения и ЭМ.Анализ профазных и прометафазных процентриолей по экспансии показал, что ингибирование Plk1 снижает среднюю длину процентриолей (Fig. 5 C). EM-анализ подтвердил результат, полученный при экспансии, и выявил процентриоли короче средней длины с вариабельностью длины их MT (рис. 5 D и рис. S3). Поздние процентриоли S / G2 клеток, ингибированных Plk1, часто были уже, чем поздние процентриоли S / G2 контрольных образцов, что согласуется с отсутствием полного набора триплетов МТ, обнаруженных в трех процентриолях, выгодно ориентированных во время сечения (рис.5 D и рис. S3). Эти данные показывают, что в циклических клетках человека активность Plk1 не является необходимой для инициации процентриолей, но важна для сборки и удлинения процентриолей MT, особенно во время митоза. Зрелые центриоли оставались интактными в отсутствие активности Plk1, это означает, что активность Plk1 не требуется для поддержания их MT, по крайней мере, в рамках наших экспериментов. Поскольку даже 200 нМ BI2356 не могут полностью исключить удлинение процентриолей во время интерфазы, вполне вероятно, что в клетках человека множественные регуляторы управляют сборкой процентриолей.В согласии с этим, Plk4 и 2 оба участвуют в удлинении центриолей (Aydogan et al., 2018; Chang et al., 2010).

В соответствии с положительной ролью Plk1 в удлинении процентриолей, анализ с помощью микроскопии стохастической оптической реконструкции (STORM) белка колеса тележки STIL выявил удлиненные колеса тележки в клетках с задержкой в ​​S-фазе, экспрессирующих Plk1TD, который был отменен добавлением ингибитора Plk1 (рис.5 E). Напротив, ингибирование Plk1 из фазы G1 или S приводило к значительно более коротким колесам тележки, чем в контрольных профазных клетках (фиг. 5 E).

В настоящее время мы не понимаем, как Plk1 регулирует удлинение процентриолей. Помимо ранее предложенного Plk2 (Chang et al., 2010), наши данные подтверждают, что Plk1 является еще одним членом семейства polo, участвующим в сборке процентриолей. Перекрываются ли и в какой степени функции Plk1 в сборке процентриолей с функциями др. Полокиназ, в настоящее время неясно, но избыточная экспрессия и ингибирование Plk1 могут явно влиять на удлинение процентилей.Интересная возможность состоит в том, что Plk2, наиболее активный в фазе G1 и ранней S (Ma et al., 2003), стимулирует удлинение процентриолей в начале клеточного цикла, в то время как Plk1, активность которого увеличивается от фазы S до митоза, стимулирует удлинение процентриол на более поздних стадиях клеточного цикла. Действительно, наши данные пока показывают, что обработка G1 с помощью BI3536, который предположительно по крайней мере частично ингибирует активность Plk2 в дополнение к активности Plk1, приводит к более пенетрантным дефектам процентриола и удлинению колеса тележки по сравнению с теми дефектами, которые наблюдаются при использовании более специфичного ингибитора Plk1 GSK.Примечательно, что как Plk2, так и Plk1 взаимодействуют с фактором удлинения центриолей CPAP (Chang et al., 2010; Novak et al., 2016).

В процессе созревания центриоли приобретают биохимические модификации, которые каким-то образом препятствуют их дальнейшему удлинению. Ранее было показано, что Plk1 способствует биохимическому созреванию центриолей (Kong et al., 2014; Loncarek et al., 2010; Tsou et al., 2009; Wang et al., 2011).Мы предполагаем, что Plk1 играет двойную роль в центриольном цикле. Он стимулирует удлинение процентриолей и в то же время способствует их постепенному созреванию, что в конечном итоге снижает их способность к удлинению. Т.о., двойная роль Plk1 в удлинении и созревании процентриолей может представлять эффективный способ механически связать эти два противоположных процесса и, в свою очередь, утверждать некоторую постоянство в размере центриолей во время невозмущенных клеточных циклов.

В заключение, наши данные могут объяснить происхождение изменчивости центриолей в популяциях клеток и почему сверхактивный Plk1 часто ассоциируется с центриолярными структурными аномалиями, и демонстрирует, почему числовые и структурные аномалии центриолей в опухолях часто совпадают.

Длинный пут

Что такое длинный пут?

Длинный пут означает покупку опциона пут, как правило, в ожидании снижения стоимости базового актива. Термин «длинный» здесь не имеет ничего общего с промежутком времени до истечения срока, а скорее относится к действиям трейдера, купившего опцион в надежде продать его по более высокой цене в более поздний момент времени. Трейдер может купить пут по спекулятивным причинам, сделав ставку на то, что базовый актив упадет, что увеличит стоимость длинного опциона пут.Длинный пут также можно использовать для хеджирования длинной позиции по базовому активу. Если базовый актив падает, стоимость пут-опциона увеличивается, помогая компенсировать убытки по базовому активу.

Изображение Джули Банг © Investopedia 2019

Ключевые выводы

  • Инвесторы покупают опционы пут, если считают, что цена ценной бумаги упадет.
  • Инвесторы могут использовать длинные опционы пут, чтобы спекулировать или хеджировать портфель.
  • Риск снижения цены ограничен с использованием стратегии длинных опционов пут.

Основы длинной руки

Длинный пут имеет цену исполнения, которая представляет собой цену, по которой покупатель пут имеет право продать базовый актив. Предположим, что базовым активом является акция, а цена исполнения опциона составляет 50 долларов. Это означает, что пут-опцион дает этому трейдеру право продать акцию по 50 долларов, даже если, например, цена упадет до 20 долларов. С другой стороны, если акция растет и остается выше 50 долларов, опцион бесполезен, потому что бесполезно продавать по 50 долларов, когда акция торгуется по 60 долларов и может быть продана там (без использования опциона).

Если трейдер желает использовать свое право на продажу базового актива по цене исполнения, он реализует опцион. Упражнения не требуются. Вместо этого трейдер может просто выйти из опциона в любое время до истечения срока его действия, продав его.

Длинный опцион пут может быть исполнен до истечения срока, если это американский опцион, тогда как европейские опционы могут быть исполнены только в дату истечения срока. Если опцион будет исполнен досрочно или истечет в деньгах, у держателя опциона будет короткая позиция по базовому активу.

Стратегия длинной позиции пут против короткой продажи акций

Длинный пут может быть выгодной стратегией для медвежьих инвесторов, а не короткая продажа акций. Короткая позиция по акциям теоретически имеет неограниченный риск, так как цена акции не ограничена потенциалом роста. Короткая позиция по акциям также имеет ограниченный потенциал прибыли, поскольку акция не может упасть ниже 0 долларов за акцию. Длинный опцион пут похож на короткую позицию по акциям, потому что потенциал прибыли ограничен. Стоимость опциона пут будет увеличиваться только до тех пор, пока базовая акция не достигнет нуля.Преимущество пут-опциона состоит в том, что риск ограничен премией, уплаченной за опцион.

Недостатком пут-опциона является то, что цена базового актива должна упасть до даты истечения срока действия опциона, в противном случае уплаченная за опцион сумма будет потеряна.

Чтобы получить прибыль от короткой торговли акциями, трейдер продает акцию по определенной цене, надеясь, что он сможет выкупить ее обратно по более низкой цене. Опционы пут аналогичны тем, что, если базовая акция упадет, стоимость опциона на продажу возрастет, и его можно будет продать с прибылью.Если опцион исполнен, трейдер откроет короткую позицию по базовой акции, и тогда трейдеру нужно будет купить базовую акцию, чтобы получить прибыль от сделки.

Длинные опционы пут на хеджирование

Длинный опцион пут также может использоваться для защиты от неблагоприятных изменений в длинной позиции по акциям. Эта стратегия хеджирования известна как защитный пут или замужний пут.

Например, предположим, что у инвестора длинная позиция на 100 акций Bank of America Corporation (BAC) по цене 25 долларов за акцию.Инвестор в долгосрочной перспективе настроен оптимистично по отношению к акциям, но опасается, что они могут упасть в следующем месяце. Таким образом, инвестор покупает один опцион пут со страйк-ценой 20 долларов за 0,10 доллара (умноженный на 100 акций, поскольку каждый опцион на продажу представляет 100 акций), срок действия которого истекает через один месяц.

Хеджирование инвестора ограничивает убыток до 500 долларов или 100 акций x (25–20 долларов) за вычетом премии (всего 10 долларов), уплаченной за опцион пут. Другими словами, даже если Bank of America упадет до 0 долларов в течение следующего месяца, максимум этот трейдер может потерять 510 долларов, потому что все потери по акциям ниже 20 долларов покрываются длинным опционом пут.

Пример использования длинной позиции в реальном мире

Предположим, Apple Inc. (AAPL) торгуется по цене 170 долларов за акцию, и вы думаете, что она упадет в цене примерно на 10% перед запуском нового продукта. Вы решаете открыть длинную позицию по 10 пут-опционам со страйк-ценой 155 долларов и заплатить 0,45 доллара. Общие затраты на вашу позицию по длинным пут-опционам составляют 450 долларов + комиссии и комиссии (1000 акций x 0,45 доллара = 450 долларов).

Если цена акций Apple упадет до 154 долларов до истечения срока, ваши опционы на продажу теперь будут стоить 1 доллар.00, так как вы можете использовать их и продать 1000 акций по цене 155 долларов и немедленно выкупить их обратно для покрытия по цене 154 доллара.

Ваша общая длинная позиция по опционам пут теперь составляет 1000 долларов — сборы и комиссии (1000 акций x 1,00 = 1000 долларов). Ваша прибыль по позиции составляет 122% (450 долларов США / 1000 долларов США). Использование длинных опционов пут позволило вам получить гораздо большую прибыль, чем падение цены базовой акции на 9,4%.

В качестве альтернативы, если акции Apple вырастут до 200 долларов, срок действия 10 опционных контрактов истечет, и вы потеряете свои первоначальные затраты в размере 450 долларов.

COVID «дальнобойщики»: долгосрочные последствия COVID-19

Что произойдет, если симптомы COVID-19 не исчезнут? У некоторых людей, выздоравливающих от COVID-19, сохраняющиеся проблемы со здоровьем могут нанести ущерб в течение нескольких месяцев.

Tae Chung, доктор медицины, специалист в области неврологии, физической медицины и реабилитации; Меган Хози, доктор философии, специалист по реабилитационной психологии; Арун Венкатесан, доктор медицинских наук, специалист в области неврологии; Аманда Морроу, доктор медицины, эксперт в области детской реабилитационной медицины; и Эмили Бригам, М.D., M.P.H., специализирующаяся на заболеваниях легких и интенсивной терапии, обсуждает долгосрочный COVID-19, какие симптомы наиболее распространены и чего можно ожидать от них.

Long COVID: что такое пост-COVID-синдром?

Легкая или умеренная форма COVID-19 длится у большинства людей около двух недель. Но другие испытывают хронические проблемы со здоровьем даже после того, как выздоровели от острой фазы болезни.

У таких пациентов больше нет буйного коронавируса в организме.В случае тестирования у человека будет отрицательный результат на коронавирус, но, тем не менее, он может быть серьезно ослаблен.

У проблемы несколько названий. Национальные институты здравоохранения называют долгосрочные симптомы COVID-19 PASC, что означает пост-острые последствия SARS-CoV-2. Более распространенные термины — это пост-COVID-синдром, длительный COVID или долгосрочный COVID. Людей, живущих с пост-COVID-синдромом, иногда называют «дальнобойщиками».

Что вызывает пост-COVID-синдром?

Хотя очевидно, что люди с определенными факторами риска (включая высокое кровяное давление, курение, диабет, ожирение и другие состояния) более склонны к серьезному приступу COVID-19, нет четкой связи между этими факторами риска и долгосрочные проблемы.На самом деле, длительный COVID может случиться у людей с легкими симптомами.

Дополнительные исследования прольют свет на то, почему эти стойкие проблемы со здоровьем сохраняются у некоторых людей. Они могут быть вызваны повреждением органов, стойким воспалительным или аутоиммунным ответом или другой причиной.

Что вызывает симптомы у дальнобойщиков?

SARS-CoV-2 может поражать организм различными способами, вызывая повреждение легких, сердца, нервной системы, почек, печени и других органов. Проблемы с психическим здоровьем могут возникать из-за горя и утраты, нерешенной боли или усталости или из-за посттравматического стрессового расстройства (ПТСР) после лечения в отделении интенсивной терапии (ОИТ).

Бригам говорит: «Мы наблюдаем спектр симптомов после острого COVID-19, некоторые из которых можно ожидать после других серьезных заболеваний. Некоторые из них несовершеннолетние, но другим людям может потребоваться дальнейшее лечение и даже повторная госпитализация ». Она отмечает, что подобные хронические проблемы могут повлиять на пациентов с другими серьезными заболеваниями.

Но что любопытно, похоже, что синдром пост-COVID-19 поражает не только людей, которые сильно болели коронавирусом. «Пациенты, которые никогда не были серьезно больны, приходят в клинику и говорят, что их жизнь теперь изменилась», — говорит Бригам.

Каковы долгосрочные последствия коронавирусной инфекции?

По данным CDC, наиболее частыми продолжительными симптомами являются усталость, одышка, кашель, боли в суставах и груди. Другие проблемы включают когнитивные проблемы, трудности с концентрацией внимания, депрессию, мышечные боли, головную боль, учащенное сердцебиение и перемежающуюся лихорадку.

Проблемы с дыханием после COVID-19

Тяжелый случай COVID-19 может вызвать рубцы и другие необратимые проблемы в легких, но даже легкие инфекции могут вызвать стойкую одышку — легко одышку даже после легкой нагрузки.

Восстановление легких после COVID-19 возможно, но требует времени. Эксперты говорят, что для восстановления функции легких человека до уровня, существовавшего до COVID-19, могут потребоваться месяцы. Могут помочь дыхательные упражнения и респираторная терапия.

Проблемы с сердцем после COVID-19

Инфекция SARS-CoV-2 может вызвать у некоторых людей проблемы с сердцем, включая воспаление сердечной мышцы. Фактически, одно исследование показало, что 60% людей, выздоровевших от COVID-19, имели признаки продолжающегося воспаления сердца, которое могло привести к общим симптомам одышки, сердцебиения и учащенного сердцебиения.Это воспаление появилось даже у тех, кто переболел COVID-19 в легкой форме и у кого не было проблем со здоровьем до того, как они заболели.

Повреждение почек от COVID-19

Если коронавирусная инфекция вызвала повреждение почек, это может повысить риск долгосрочного заболевания почек и необходимость диализа.

Потеря или искажение обоняния и вкуса после COVID-19

Чувства запаха и вкуса связаны, и поскольку коронавирус может поражать клетки в носу, наличие COVID-19 может привести к изменению или потере обоняния или вкуса.До и после того, как люди заболеют COVID-19, они могут полностью потерять обоняние или вкус или обнаружить, что знакомые вещи пахнут или имеют неприятный, странный или другой вкус.

Примерно у четверти людей с COVID-19, у которых есть один или оба этих симптома, проблема решается за пару недель. Но у большинства эти симптомы сохраняются. Длительное искажение этих чувств, хотя и не опасно для жизни, может иметь разрушительные последствия и привести к отсутствию аппетита, тревоге и депрессии. Некоторые исследования показывают, что вероятность того, что у этих людей улучшится обоняние в течение года, составляет от 60% до 80%.

Неврологические проблемы при длительном COVID

Невролог Арун Венкатесан, доктор медицинских наук, говорит: «У некоторых людей после заражения COVID развиваются среднесрочные и долгосрочные симптомы, включая туман в мозгу, усталость, головные боли и головокружение. Причина этих симптомов неясна, но активно исследуется ».

Симптомы вегетативной нервной системы после COVID-19

Синдром постуральной ортостатической тахикардии или POTS — это состояние, которое влияет на кровообращение, и люди, пережившие COVID-19, могут быть более уязвимы к нему.Доктор медицины Тэ Чунг, специализирующийся на физической медицине и реабилитации, говорит: «ГОРШКИ могут оставлять выживших с другими неврологическими симптомами, включая продолжающуюся головную боль, усталость, мозговой туман, трудности с мышлением или концентрацией внимания и бессонницу.

Даже у пациентов без POTS стойкая бессонница после COVID-19 или «COVID-сомния» становится все более частой жалобой среди выживших после COVID-19.

Проблемы с психическим здоровьем после COVID-19

Пережив COVID-19, у некоторых людей сохраняется тревога, депрессия и другие проблемы с психическим здоровьем.Физические изменения, такие как боль и слабость, могут осложняться длительными периодами изоляции, стрессом из-за потери работы и финансовых трудностей, а также горя из-за смерти близких и потери хорошего здоровья.

Пациенты, которые были госпитализированы, выздоравливают особенно тяжело. Бригам говорит: «Синдром пост-интенсивной терапии, или PICS, подвергает переживших COVID-19 и других людей, которые провели время в отделении интенсивной терапии, более высокому риску проблем с психическим здоровьем, когнитивными способностями и физическим восстановлением.”

Меган Хози, доктор философии, психолог-реабилитолог, говорит, что длительное пребывание в отделении интенсивной терапии может вызвать делирий. Странное окружение, множество лекарств, изменяющих сознание, изоляция и потеря контроля могут вызывать у пациентов длительные и повторяющиеся ощущения ужаса или страха, включая посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР).

«У многих пациентов появляются галлюцинации, когда они верят, что медицинские работники пытаются им навредить», — говорит Хози. «У нас были пациенты, которые рассказывали нам такие вещи, как« Я думал, что меня хоронят заживо », когда их помещали на МРТ.”

Сахарный диабет после COVID-19

Связь между COVID-19 и диабетом, особенно диабетом 2 типа, сложна. Диабет 2 типа является фактором риска серьезных случаев COVID-19, и у некоторых выживших, похоже, развиваются признаки диабета 2 типа после выздоровления от COVID-19.

Симптомы дальнобойного коронавируса у детей и подростков

Пока не известно, будут ли у детей, переболевших COVID-19, более или менее вероятно, чем у взрослых, иметь постоянные симптомы.Но возможен долгосрочный COVID-19 у детей, который проявляется в виде усталости, депрессии, одышки и других симптомов, связанных с длительным путешествием.

Аманда Морроу, доктор медицины, специалист в области физической медицины и реабилитации, входит в многопрофильную команду педиатрической реабилитационной клиники после COVID-19 Института Кеннеди Кригера, которая занимается устранением хронических симптомов коронавируса у детей и подростков. По ее словам, непонятно, почему длительные симптомы COVID-19 поражают одних детей, а других — нет.

«Мы наблюдаем пациентов, которые часто являются очень хорошо функционирующими, здоровыми детьми, у которых не было каких-либо заболеваний или заболеваний», — говорит она, отмечая, что у многих детей, проходящих лечение в клинике, были только легкие приступы COVID-19. .

Воспаление сердца после COVID-19 вызывает беспокойство, особенно среди молодых спортсменов, возвращающихся к занятиям спортом после легкого или даже бессимптомного случая коронавируса. Их следует обследовать на предмет любых признаков повреждения сердца, чтобы убедиться, что они могут безопасно возобновить деятельность.

Дети, которые испытали (к счастью) очень редкое осложнение COVID-19, называемое мультисистемным воспалительным синдромом у детей, или MIS-C, могут остаться с серьезным поражением сердца, и их должен сопровождать детский кардиолог.

Долгосрочные проблемы с COVID-19 бросают вызов и здравоохранению

Бригам говорит, что огромные масштабы ухода за пациентами с сохраняющимися симптомами COVID-19 представляют собой серьезную проблему. Она отмечает, что врачи наблюдали поствирусные симптомы у пациентов, пострадавших от двух других коронавирусных заболеваний — тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) и ближневосточного респираторного синдрома (MERS).

Но, по ее словам, вспышки этих болезней были ограниченными. COVID-19 было на миллионы людей больше, чем SARS или MERS, поэтому потенциальная проблема сохраняющихся проблем со здоровьем огромна, особенно в контексте пандемии, с изоляцией, экономическим невыгодным положением, отсутствием доступа и изменением распорядка дня, еще более усугубляющим сложности долгосрочное лечение COVID-19.

Как долго может длиться COVID-19 в долгосрочной перспективе?

Когда дело доходит до COVID-19, насколько долго это «долгосрочный»? Ответ неизвестен.Хотя кажется, что с начала пандемии прошло очень много времени, COVID-19 начал широко распространяться только в начале 2020 года, и подавляющее большинство людей, переболевших этой болезнью, выздоравливают всего через год или меньше.

Потребуется больше времени, чтобы понять, что будет дальше с пациентами, которые выздоровели от COVID-19 и все еще имеют связанные с этим проблемы со здоровьем.

Как лечить затяжной COVID-19?

Врачи и терапевты помогут вам устранить симптомы.Команда Johns Hopkins Post-Acute COVID-19 (JH PACT) — это специальная многопрофильная клиника для поддержки выздоровления людей, перенесших COVID-19, и аналогичные клиники появляются в других больницах.

Дыхательные упражнения, физиотерапия, лекарства и другие методы лечения могут помочь улучшить ваше здоровье, но будьте готовы к постепенному выздоровлению.

Как предотвратить длительный COVID-19?

Лучший способ избежать осложнений после COVID-19 — это в первую очередь предотвратить заражение коронавирусом.Соблюдение мер предосторожности против коронавируса и получение вакцины от COVID-19, как только она станет вам доступна, — это эффективные способы избежать заражения COVID-19.

Понимание серьезности COVID-19 и его способности к долгосрочным изнурительным симптомам является хорошей мотивацией для защиты себя и других путем постоянного и правильного ношения лицевой маски, когда вы находитесь рядом с людьми, не проживающими в вашем доме; поддержание физического расстояния не менее шести футов от людей за пределами вашего дома; и соблюдение тщательной гигиены рук.

Когда мне следует обратиться к врачу по поводу симптомов пост-COVID-19?

Долговременные симптомы COVID-19 могут быть похожи на признаки другого заболевания, поэтому важно обратиться к врачу и исключить другие проблемы, такие как проблемы с сердцем или заболевание легких.

Не игнорируйте потерю обоняния, депрессию, беспокойство или бессонницу и не списывайте их на мелочь или «все в вашей голове». Любой симптом, который мешает вашей повседневной жизни, стоит позвонить своему врачу, который поможет вам решить эти проблемы и улучшить качество вашей жизни.

Если вы почувствуете новую боль в груди, затрудненное дыхание, посинение губ или любой другой признак опасной для жизни проблемы, немедленно позвоните в службу 911 или в службу экстренной помощи.

Больше информации о долговременном COVID-19 появится

SARS-CoV-2, вирус, вызывающий COVID-19, был идентифицирован в декабре 2019 года. Нам еще многое предстоит узнать об этом, но наше понимание вируса и COVID-19 развивается с каждым днем.

Исследователи узнают больше о том, как и почему коронавирус поражает разных людей по-разному, и почему у некоторых людей вообще нет симптомов, в то время как у других есть опасное для жизни повреждение органов или длительная инвалидность.Новые идеи откроют возможности для лечения и надежды для людей, живущих с долгосрочными последствиями COVID-19.

РАСТЯЖЕНИЕ И ГИБКОСТЬ — Типы растяжения

Перейти к предыдущей, следующей главе.

Так же, как существуют разные типы гибкости, есть также
разные виды растяжки. Растяжки бывают либо динамическими (то есть
они связаны с движением) или статичными (то есть в них нет движения).
Динамическая растяжка влияет на динамическую гибкость, а статическая растяжка — на
статическая гибкость (и в некоторой степени динамическая гибкость).

Существуют различные типы растяжки:

  1. баллистическое растяжение
  2. динамическое растяжение
  3. активная растяжка
  4. пассивная (или расслабленная) растяжка
  5. статическое растяжение
  6. изометрическое растяжение
  7. Растяжение PNF

Баллистическое растяжение использует импульс движущегося тела или конечности в
попытаться заставить его выйти за пределы его нормального диапазона движения. Это
растяжка, или «разминка», подпрыгивая в (или из) растянутой
положение, используя растянутые мышцы как пружину, которая вытаскивает вас из
растянутое положение.(например, многократно подпрыгивая, чтобы коснуться вашего
пальцы ног.) Этот тип растяжения не считается полезным и может привести к
травма, повреждение. Это не позволяет вашим мышцам адаптироваться и расслабляться в
растянутое положение. Вместо этого это может заставить их сжаться на
многократно активируя рефлекс растяжения (см. раздел «Рефлекс растяжения»).

Динамическое растяжение , согласно Kurz , «включает движущиеся части
вашего тела и постепенно увеличивая досягаемость, скорость движения или
оба.«Не путайте динамическую растяжку с баллистической!
Динамическая растяжка состоит из контролируемых движений ног и рук, которые требуют
вы (осторожно!) до пределов вашего диапазона движений. Баллистический
растяжки включают попытку заставить часть тела выйти за ее
диапазон движения. В динамических растяжках нет отскоков или «рывков».
движения. Пример динамического растяжения: медленное, контролируемое
махи ногами, махи руками или повороты туловища.

Динамическая растяжка улучшает динамическую гибкость и весьма полезна в качестве
часть вашей разминки перед активной или аэробной тренировкой (например, танец
или уроки боевых искусств).См. Раздел «Разминка».

Согласно Kurz упражнения на динамическую растяжку следует выполнять
в подходах по 8-12 повторений. Обязательно остановитесь, когда и если почувствуете
устала. Усталые мышцы обладают меньшей эластичностью, что уменьшает диапазон
движение, используемое в ваших движениях. Продолжая тренироваться, когда вы
усталость служит только для того, чтобы восстановить нервный контроль длины ваших мышц на
ограниченный диапазон движений, используемых в упражнении (и приведет к потере
гибкости). Как только вы достигнете максимального диапазона движений сустава
в любом направлении, вы должны прекратить делать это движение во время этого
тренировка.Усталые и перегруженные мышцы не смогут
движение и кинестетическая память мышцы будут помнить повторяющиеся
ограниченный диапазон движений, который вам придется преодолеть, прежде чем
вы можете добиться дальнейшего прогресса.

Активное растяжение также обозначается как статически-активное
растяжка
. Активная растяжка — это та, где вы занимает позицию и
затем удерживайте его там без какой-либо помощи, кроме как с помощью силы
ваши мышцы-агонисты (см. раздел «Взаимодействующие группы мышц»).Например,
высоко подняв ногу, а затем удерживая ее там без чего-либо
(кроме самих мышц ног), чтобы ногу
расширенное положение. Напряжение агонистов при активном растяжении
помогает расслабить растягиваемые мышцы (антагонисты) за счет
реципрокное торможение (см. раздел «Взаимное торможение»).

Активная растяжка увеличивает активную гибкость и укрепляет
агонистические мышцы. Активную растяжку обычно довольно сложно
удерживать и поддерживать более 10 секунд и редко нужно удерживать
дольше 15 секунд.

Многие из движений (или растяжек), встречающихся в различных формах йоги, являются
активные растяжки.

Пассивное растяжение также обозначается как расслабленное растяжение ,
и как статически-пассивное растяжение . Пассивное растяжение — это то, где
вы принимаете позу и удерживаете ее какой-то другой частью тела,
или с помощью партнера или другого предмета. Например,
высоко подняв ногу, а затем придерживая ее рукой.В
шпагат является примером пассивной растяжки (в данном случае пол
«аппарат», который вы используете для сохранения вытянутого положения).

Медленная, расслабленная растяжка полезна для снятия спазмов в мышцах, которые
заживают после травмы. Очевидно, вам следует свериться со своим
сначала врач, чтобы увидеть, можно ли пытаться растянуть травмированного
мышцы (см. раздел Боль и дискомфорт).

Расслабленная растяжка также очень хороша для «остывания» после тренировки.
и помогает уменьшить мышечную усталость и болезненность после тренировки.См. Раздел Охлаждение.

Многие используют термины «пассивная растяжка» и «статическая растяжка».
взаимозаменяемо. Однако есть ряд людей, которые
различие между ними. Согласно M. Alter ,
Статическое растяжение состоит из растяжения мышцы (или группы мышц)
до самой дальней точки, а затем удерживая или удерживая эту позицию,
тогда как Пассивная растяжка состоит из расслабленного человека, который
расслаблен (пассивен), в то время как некоторая внешняя сила (человек или
аппарат) перемещает сустав через диапазон его движений.

Обратите внимание, что определение пассивного растяжения, приведенное в
предыдущий раздел охватывает и приведенных выше определений.
В этом документе, когда термин статическое растяжение
или используется пассивное растяжение , его предполагаемое значение
определение пассивного растяжения, как описано в предыдущем
раздел. Однако вы должны знать об этих альтернативных значениях,
при просмотре других ссылок на растяжку.

Изометрическое растяжение — это тип статического растяжения (то есть
не использует движения), что связано с сопротивлением групп мышц
за счет изометрических сокращений (напряжения) растянутых мышц
(см. раздел «Типы мышечных сокращений»).Использование изометрической растяжки
это один из самых быстрых способов улучшить статико-пассивное
гибкость и намного эффективнее, чем пассивная растяжка или
одна активная растяжка. Изометрическая растяжка также помогает развить
сила в «напряженных» мышцах (что способствует развитию статико-активных
гибкость), и, кажется, обычно уменьшает количество боли
связанные с растяжкой.

Наиболее распространенные способы обеспечения необходимого сопротивления изометрической
растяжка — это прикладывать сопротивление к собственным конечностям вручную, чтобы
партнер применить сопротивление, или использовать какой-либо предмет, например стену
(или пол), чтобы оказать сопротивление.

Примером ручного сопротивления может быть удержание мяча вашего
стопу, чтобы она не сгибалась, пока вы задействуете мышцы своего
икры, чтобы попытаться выпрямить подъем стопы так, чтобы пальцы ног были заострены.

Примером использования партнера для оказания сопротивления может быть
партнер высоко поднимает вашу ногу (и держит ее там), пока вы пытаетесь
опустите ногу обратно на землю.

Примером использования стены для обеспечения сопротивления может служить колодец.
известная растяжка «толкни стену», когда вы активно пытаетесь
переместите стену (даже если знаете, что не можете).

Изометрическая растяжка не рекомендуется для детей и детей .
подростки, кости которых еще растут. Эти люди обычно
уже достаточно гибкий, чтобы сильные растяжения, производимые
изометрические сокращения имеют гораздо более высокий риск повреждения сухожилий и
соединительная ткань. Kurz настоятельно рекомендует перед любым изометрическим
растяжка мышцы с динамической силовой тренировкой, чтобы мышцы были
растянуты. Полный сеанс изометрической растяжки предъявляет много требований
на растягиваемые мышцы и не должны выполняться более чем
один раз в день для данной группы мышц (в идеале не более одного раза
каждые 36 часов).

Правильный способ выполнения изометрической растяжки следующий:

  1. Примите положение пассивного растяжения желаемой мышцы.
  2. Затем напрягите растянутую мышцу на 7-15 секунд (сопротивляясь
    некоторая сила, которая не будет двигаться, например, пол или партнер).
  3. Наконец, расслабьте мышцу как минимум на 20 секунд.

Некоторые люди, кажется, рекомендуют удерживать изометрическое сокращение в течение
дольше 15 секунд, но согласно SynerStretch (
видеопленка), исследования показали, что в этом нет необходимости.Так что вы могли бы
а также сделайте растяжку менее затратной по времени.

Как работает изометрическая растяжка

Вспомните из нашего предыдущего обсуждения (см. Раздел «Как сокращаются мышцы»).
что не существует частично сокращенного мышечного волокна:
когда мышца сокращается, некоторые волокна сокращаются, а некоторые
оставаться в состоянии покоя (задействуется больше волокон, поскольку нагрузка на мышцы
увеличивается). Точно так же, когда мышца растягивается, некоторые из
волокна удлинены, а некоторые остаются в покое (см. раздел «Что происходит при растяжке»).Во время изометрического сокращения некоторые из
покоящиеся волокна натягиваются с обоих концов мускулами
которые сокращаются. В результате некоторые из отдыхающих
волокна растягиваются!

Обычно горстка волокон, которые растягиваются во время изометрической
сокращения не очень значительны. Истинная эффективность
изометрическое сокращение происходит, когда мышца, которая уже находится в
растянутое положение подвергается изометрическому сокращению. В этом
В этом случае некоторые мышечные волокна уже растянуты до того, как
сокращение, и, если удерживаться достаточно долго, начальное пассивное растяжение
преодолевает рефлекс растяжения (см. раздел «Рефлекс растяжения») и запускает
реакция удлинения (см. раздел Реакция удлинения), подавляющая
растянутые волокна от сокращения.На данный момент, согласно
SynerStretch , когда вы изометрически сокращены, немного отдыхаете
волокна будут сокращаться, а некоторые покоящиеся волокна растянутся.
Кроме того, можно предотвратить растяжение многих волокон.
от сокращения обратным миотатическим рефлексом (удлинение
реакция) и протянул бы еще больше. Когда изометрическое сокращение
завершается, сокращающиеся волокна возвращаются к своей длине покоя, но
растянутые волокна запомнили бы свою протянутую длину и (для
период времени) сохраняют способность увеличиваться по сравнению с их предыдущими
предел.Это позволяет всей мышце растягиваться за пределы своего первоначального положения.
максимум и приводит к повышенной гибкости.

Причина в том, что растянутые волокна развиваются и сохраняют способность к
растягиваться за пределы своего обычного предела во время изометрической растяжки необходимо делать
с мышечными веретенами (см. раздел Проприорецепторы): сигнал, который
сообщает мышце о произвольном сокращении, а также сообщает мышце
мышечные волокна веретена (интрафузальные) сокращаются, повышая чувствительность
рефлекса растяжения. Этот механизм обычно поддерживает
чувствительность мышечного веретена, так как мышца укорачивается во время
сокращение.Это позволяет мышечным веретенам привыкнуть (стать
привыкли) к еще более удлиненному положению.

Растяжение PNF в настоящее время является самым быстрым и эффективным способом
известно, что увеличивает статико-пассивную гибкость. PNF — это аббревиатура
для проприоцептивного нервно-мышечного облегчения . Нет
действительно тип растяжки, но это техника сочетания пассивных
растяжка (см. раздел «Пассивное растягивание») и изометрическая растяжка
(см. раздел «Изометрическое растяжение») для достижения максимального статического
гибкость.На самом деле, термин «растяжение PNF» неверен.
PNF изначально разрабатывался как метод реабилитации после инсульта.
жертвы. PNF относится к любой из нескольких постизометрической релаксации
техники растяжки, при которых пассивно растягивается группа мышц,
затем сжимается изометрически против сопротивления в то время как в
растянутое положение, а затем снова пассивно растягивается через
в результате увеличился диапазон движений. Растяжение PNF обычно
использует партнера для сопротивления
изометрическое сокращение, а затем пассивное выполнение сустава
благодаря увеличенному диапазону движений.Однако это может быть выполнено
без партнера, хотя обычно это более эффективно с
помощь партнера.

В большинстве методов растяжения PNF используется изометрический агонист .
сокращение / расслабление
, при котором растянутые мышцы сокращаются
изометрически, а затем расслаблено. Некоторые методы PNF также используют
изометрическое сокращение антагонистов где антагонисты
растянутые мышцы сокращаются. Во всех случаях важно отметить
чтобы растянутые мышцы находились в состоянии покоя (и расслабления) не менее 20
секунд перед выполнением другой техники PNF.Самый распространенный PNF
техники растяжки:

фиксация-релакс

Эту технику также называют контрактом-расслаблением . После предположения
начальное пассивное растяжение, растягиваемая мышца изометрически
сокращается на 7-15 секунд, после чего мышца ненадолго расслабляется
на 2-3 секунды, а затем сразу подвергнуть пассивной растяжке
который растягивает мышцу даже больше, чем начальная пассивная
протяжение. Эта последняя пассивная растяжка длится 10-15 секунд.В
затем мышца расслабляется в течение 20 секунд перед выполнением еще одного PNF
техника.

удержание-расслабление-контракт

Этот метод также называется контракт-расслабление-контракт , а метод
контракт-релакс-антагонист-контракт (или CRAC ). Это включает в себя
выполнение двух изометрических сокращений: сначала агонистов, затем
антагонисты. Первая часть похожа на удержание-расслабление, где,
после начального пассивного растяжения растянутая мышца
изометрически сжимается на 7-15 секунд.Затем мышца расслабляется
в то время как его антагонист немедленно выполняет изометрическое сокращение, которое
держится 7-15 секунд. Затем мышцы расслабляются на 20 секунд.
перед выполнением другой техники PNF.

удержание-расслабление-качели

Эта техника (и аналогичная техника под названием удержание-расслабление-отскок )
фактически предполагает использование динамических или баллистических растяжек в
в сочетании со статической и изометрической растяжкой. Это очень
рискованно, и успешно используется только самыми продвинутыми спортсменами
и танцоры, которым удалось достичь высокого уровня контроля
над рефлексом растяжения мышц (см. раздел «Рефлекс растяжения»).Это
похожа на технику удержания-расслабления, за исключением того, что динамический или
баллистическое растяжение используется вместо последнего пассивного растяжения.

Обратите внимание, что в контракте удержания-расслабления нет заключительного пассивного
протяжение. Он заменяется сокращением антагониста, которое через
реципрокное торможение (см. раздел Взаимное торможение), служит для расслабления
и далее растянуть мышцу, подвергшуюся первоначальному пассивному
протяжение. Поскольку нет заключительного пассивного растяжения, этот метод PNF
считается одним из самых безопасных методов PNF для выполнения (он менее
может привести к разрыву мышечной ткани).Некоторым нравится делать
еще более интенсивную технику, добавив последнюю пассивную растяжку после
второе изометрическое сжатие. Хотя это может привести к большему
увеличивается гибкость, это также увеличивает вероятность травм.

Еще более рискованными являются методы динамического и баллистического растяжения PNF.
как удержание-расслабление-качание и удержание-расслабление-отскок. Если ты
не профессиональный спортсмен или танцор, у вас наверняка нет бизнеса
попытка использования любого из этих методов (вероятность получения травмы
просто слишком здорово).Даже профессионалы не должны пытаться это сделать.
техники без руководства профессионального тренера или обучения
советник. Эти два метода обладают наибольшим потенциалом для быстрого
гибкость увеличивается, но только когда выполняется людьми, имеющими
достаточно высокий уровень контроля рефлекса растяжения в
мышцы, которые растягиваются.

Подобно изометрическому растяжению (см. Раздел «Изометрическое растяжение»), PNF
растяжка также не рекомендуется детям и людям, у которых
кости все еще растут (по тем же причинам.Также нравится изометрический
растяжка, растяжка PNF помогает укрепить мышцы, которые
сокращен и, следовательно, хорош для увеличения активной гибкости
а также пассивная гибкость. Кроме того, как и в случае с изометрическими
растяжение, растяжение PNF очень напряженное и должно выполняться
для данной группы мышц не чаще одного раза в день (в идеале
более одного раза в 36-часовой период).

Первоначально рекомендуемая процедура для растяжения PNF заключается в выполнении
желаемая техника PNF 3-5 раз для данной группы мышц (в состоянии покоя 20
секунд между каждым повторением).Однако HFLTA ссылается на 1987 г.
исследование, результаты которого показывают, что выполнение 3-5 повторений PNF
техника для данной группы мышц не обязательно будет более эффективной
чем выполнение техники только один раз. В результате, чтобы
уменьшить количество времени, затрачиваемого на растяжку (без
снижая его эффективность), HFLTA рекомендует выполнять только
одна техника PNF на группу мышц, растянутую при заданном растяжении
сеанс.

Как работает растяжка PNF

Помните, что во время изометрической растяжки, когда мышцы работают
изометрическое сокращение расслаблено, сохраняет способность растягиваться
сверх его начальной максимальной длины (см. раздел «Как работает изометрическое растягивание»).Что ж, PNF пытается немедленно воспользоваться этим увеличенным
диапазон движения, немедленно подвергая сокращенную мышцу
пассивная растяжка.

Изометрическое сокращение растянутой мышцы выполняет несколько
вещи:

  1. Как объяснялось ранее (см. Раздел Как работает изометрическое растяжение),
    помогает тренировать рецепторы растяжения мышечного веретена
    сразу приспосабливать мышцы большей длины.
  2. Интенсивное сокращение мышц и тот факт, что оно сохраняется в течение
    период времени, служит для утомления многих быстро сокращающихся волокон
    сокращение мышц (см. раздел «Быстрые и медленные мышечные волокна»).Это делает
    Усталым мышечным волокнам труднее сокращаться при сопротивлении
    последующее растяжение (см. раздел «Рефлекс растяжения»).
  3. Напряжение, создаваемое сокращением, активирует сухожилие Гольджи.
    орган (см. раздел Проприорецепторы), который подавляет сокращение мышцы
    через реакцию удлинения (см. раздел «Реакция удлинения»).
    Произвольное сокращение во время растяжки увеличивает напряжение в мышце,
    активизация органов сухожилий Гольджи больше, чем простая растяжка.Так,
    когда произвольное сокращение прекращается, мышца становится еще больше
    препятствует сокращению при последующем растяжении.

Методы растяжения PNF используют внезапную «уязвимость»
мышцы и ее увеличенного диапазона движений за счет использования периода
время сразу после изометрического сокращения для тренировки
рецепторы растяжения, чтобы привыкнуть к этому новому, расширенному диапазону мышц
длина. Это то, что финальный пассив (или в некоторых случаях динамический)
растяжка выполняет.

Перейти к предыдущей, следующей главе.

Митотические CDK контролируют переход метафаза-анафаза и запускают удлинение веретена

  1. Рами Рахал и
  2. Анжелика Амон1
  1. Центр исследований рака, Медицинский институт Говарда Хьюза, Массачусетский технологический институт, Кембридж, Массачусетс
    02139 США

Абстрактные

Митотические циклин-зависимые киназы (CDK) контролируют вступление в митоз, но их роль во время митотической прогрессии хуже
понял.Здесь мы охарактеризуем функции активности CDK, связанные с митотическими циклинами Clb1, Clb2 и Clb3. Мы
показывают, что Clb-CDK важны для активации комплекса / циклосомы, стимулирующего анафазу убиквитинлигазы (APC / C) -Cdc20
который запускает переход от метафазы к анафазе. Кроме того, мы определяем важную роль активности Clb-CDK в анафазе.
удлинение шпинделя. Таким образом, митотические CDK служат не только для инициации фазы М, но также необходимы постоянно на протяжении митоза.
для запуска ключевых митотических событий, таких как активация APC / C и удлинение веретена анафазы.

Цель митоза — точное разделение дублированного генома между двумя дочерними клетками. Расщепление хромосом
происходит во время анафазы и запускается растворением связей, которые удерживают вместе сестринские хроматиды (Nasmyth 2002). Эти связи опосредуются комплексами когезинов, которые у почкующихся дрожжей состоят из Scc1 / Mcd1, Scc3, Smc1 и Smc3.
(Нэсмит 2002).В начале анафазы субъединица когезина Scc1 / Mcd1 расщепляется протеазой Separase (Esp1 у почкующихся дрожжей), что приводит к
к потере сцепления между сестринскими хроматидами и последующей сегрегации хромосом (Nasmyth 2002). Перед анафазой Separase / Esp1 остается неактивным за счет связывания Securin (Pds1 в почкующихся дрожжах) (Nasmyth 2002). При переходе от метафазы к анафазе Securin / Pds1 нацелен на протеосомную деградацию известной убиквитинлигазой.
как комплекс / циклосома, стимулирующий анафазу (APC / C), и его фактор специфичности Cdc20 (APC / C – Cdc20) (Peters 2006).

APC / C – Cdc20 регулируется на нескольких уровнях. Механизмы наблюдения, такие как контрольные точки повреждения ДНК и сборки веретена
отрицательно регулируют активность APC / C – Cdc20. У почкующихся дрожжей контрольная точка повреждения ДНК останавливает клеточный цикл в метафазе.
путем стабилизации Securin / Pds1 (Cohen-Fix and Koshland 1997; Sanchez et al. 1999; Tinker-Kulberg and Morgan 1999; Wang et al. 2001; Agarwal et al. 2003; Searle et al. 2004). В ответ на неприсоединенные кинетохоры контрольная точка сборки веретена предотвращает переход метафаза-анафаза, ингибируя
взаимодействие между Cdc20 и APC / C (Musacchio and Salmon 2007).Однако эти две контрольные точки — не единственные механизмы, ограничивающие активность APC / C – Cdc20 метафазой – анафазой.
переход, потому что их комбинированная инактивация не вызывает преждевременного вступления в анафазу (Lee et al. 2002). Считается, что фосфорилирование APC / C – Cdc20 циклин-зависимыми киназами (CDK) (и другими киназами) активирует убиквитин.
лигаза при переходе метафаза – анафаза. Однако данные, подтверждающие этот вывод, во многом получены in vitro.
исследования (Peters 2006).Единственные доказательства участия CDK в регуляции APC / C in vivo получены из исследований на почкующихся дрожжах. Компромисс
митотическая активность CDK привела к дефектам деградации Securin / Pds1 и мутации сайтов фосфорилирования CDK внутри
почкующиеся дрожжевые APC / C-субъединицы Cdc16, Cdc23 и Cdc27 к аланинам вызывают 15-минутную задержку метафазы (Rudner and Murray 2000). Обусловлена ​​ли тонкость этого фенотипа дополнительными сайтами фосфорилирования CDK на других компонентах APC / C или
Вклад CDK в активацию APC / C – Cdc20 незначителен, неясен.

Митотические CDKs наиболее известны своей ролью в запуске митоза (Miele 2004). Они состоят из каталитической субъединицы CDK и регуляторной субъединицы циклина B-типа. Митотические CDK способствуют развитию ядерной оболочки
разрушение, сборка и организация веретена, конденсация хромосом и фрагментация Гольджи, а также способствуют регуляции APC / C
(Нигг 2001; Миле 2004). Бутонирующие дрожжи содержат одну субъединицу CDK, CDC28 , и шесть циклинов B-типа, CLB1-6 , которые имеют перекрывающиеся функции в S фазе и митозе (Andrews and Measday 1998).Clb1, Clb2, Clb3 и Clb4 вместе необходимы для вступления в митоз (Fitch et al. 1992; Richardson et al. 1992; Amon et al. 1993), что у дрожжей определяется разрывом моста, соединяющего два дублированных полюсные тела веретена (СПБ) (центросомы дрожжей)
и формирование биполярного веретена. Clb1 и Clb2 также необходимы для прохождения митоза после вступления.
в митоз (Сурана и др., 1991; Фитч и др., 1992; Ричардсон и др., 1992).Комбинированная инактивация CLB1 и CLB2 блокирует клетки с одним неразделенным ядром и коротким биполярным веретеном (Surana et al. 1991; Fitch et al. 1992; Richardson et al. 1992). Однако молекулярная причина этого ареста была неизвестна.

Здесь мы охарактеризуем последствия потери активности Clb1 / 2-CDK или Clb2 / 3-CDK на прогрессирование через митоз. Мы нашли
что активность Clb1 / 2-CDK необходима для своевременной деградации Securin / Pds1 при переходе от метафазы к анафазе, обеспечивая
доказательства необходимости активности CDK для активации APC / C – Cdc20 in vivo.Кроме того, наши исследования открывают новую роль
для активности Clb1 / 2-CDK в обеспечении перехода метафаза-анафаза после расщепления когезином. Наблюдение, что декольте
cohesin достаточно для запуска удлинения анафазного веретена (Uhlmann et al. 2000), что привело к мнению, что удлинение анафазного веретена было просто следствием потери сцепления сестринских хроматид. Мы нашли
что это не так, но активность Clb1 / 2-CDK необходима для возникновения анафазного удлинения веретена.Наконец, мы
показывают, что комбинированная инактивация активности Clb2 и Clb3-CDK также приводит к дефектам деградации Securin / Pds1 и веретена.
удлинение, подтверждая, что общие уровни активности Clb-CDK важны для того, чтобы происходили эти два митотических события. Наша работа
указывает на то, что митотические CDK не только инициируют переход в фазу M, но и необходимы на нескольких этапах митоза для
успешное завершение ключевых событий на этой стадии клеточного цикла.

Результаты

Ядерное деление нарушено в клетках, лишенных активности Clb1 / 2 – CDK

Чтобы изучить роль комплексов Clb1 – CDK и Clb2 – CDK в митотической прогрессии, мы исследовали фенотип клеток, лишенных
этих циклинов путем комбинирования термочувствительного аллеля CLB2 , clb2-VI (Amon et al.1993) с делецией CLB1 , далее clb1Δ clb2-VI . Эта комбинация аллелей является рецессивной (дополнительный рисунок 1A), и при разрешающей температуре (25 ° C) клетки clb1Δ clb2-VI являются жизнеспособными и проходят через клеточный цикл с кинетикой дикого типа (рисунок 1A; дополнительный рисунок). . 1Б, В). Однако при температурах от 36,5 ° C до 37,5 ° C жизнеспособность клеток clb1Δ clb2-VI значительно снижается (рис. 1A). Аллель clb2-VI , который содержит четыре аминокислотные замены (D232G, L286S, K353R и D485G), не является нулевым по белку при рестриктивном
температура (дополнительный рис.1D), указывая на то, что комплексы киназы Clb2-CDK неактивны в этих клетках.

Фигура 1.

CLB1 и CLB2 необходимы для прогрессирования через митоз. ( A ) Десятикратное серийное разведение клеток дикого типа (A1411) и clb1Δ clb2-VI клеток (A3000), каждая из которых несет слияние Cdc14-3HA на планшетах YEPD.Планшеты инкубировали при комнатной температуре (RT) или 37 ° C в течение
3 дн. ( B ) Клетки дикого типа, несущие слияние Cdc14-3HA (A1411) и клетки clb1Δ clb2-VI , несущие слияния Pds1-13Myc и Cdc14-3HA (A12159), были арестованы в G1 в YEPD с α-фактором (5 мкг / мл) в течение 2,5 ч при
комнатная температура. Клетки промывали 10 об. YEP и помещали в среду YEPD, не содержащую феромонов, предварительно нагретую до 37 ° C. Процент
клеток в метафазе и анафазе определяли в указанные моменты времени.Каждый раз подсчитывали не менее 100 клеток.
точка. ( C ) Морфология веретена клеток дикого типа (A1411) и clb1Δ clb2-VI (A3000), каждая из которых несет слияние Cdc14-3HA через 120 минут после высвобождения из индуцированной феромонами остановки G1. Микротрубочки
показаны зеленым цветом, а ДНК — синим. ( D ) Покадровая серия клеток дикого типа (A16772) и clb1Δ clb2-VI (A17122), несущих слияние Tub1-GFP. Клетки получали, как описано в материалах и методах.Для покадровой
Каждую минуту собирались восемь стопок по 0,5 мкм Z , а затем стопки Z проецировались в плоскости XY для измерения длины шпинделя. Измерения длины шпинделя проводились с помощью программного обеспечения softWoRx. Время * соответствует
к времени после отделения SPB, с моментом времени 0, определенным как первый момент времени, в котором два разделенных SPB явно
решено.( Верхняя панель ) Покадровая серия клеток дикого типа, претерпевающих анафазу (показано в дополнительном фильме 1). Эта ячейка была выбрана
потому что он инициировал анафазу во время, аналогичное среднему времени начала анафазы у популяций дикого типа. ( Нижняя панель ) Покадровая серия клеток clb1Δ clb2-VI , претерпевающих анафазу (показано в дополнительном фильме 2). Эта ячейка была выбрана потому, что она инициировала анафазу примерно в то же время
к среднему времени наступления анафазы в популяции clb1Δ clb2-VI .(График) Расстояние между двумя разделенными SPB в каждой ячейке измерялось в каждом
момент времени, в котором шпиндель был в фокусе. ( E ) Электронные микрофотографии среза дрожжевых клеток, полученных замораживанием под высоким давлением и замещения замораживанием (см. Материал
и методы). SPB отмечены звездочками, а микротрубочки указаны стрелками. Полоса на каждом изображении представляет
500 нм. ( Левая панель ) Срез клетки дикого типа, подвергающейся делению ядра при 37 ° C.В этом разделе был виден только один SPB и половина
шпиндель был четко решен. ( Средняя панель ) Веретено из ячейки clb1Δ clb2-VI при 37 ° C. В этом разделе четко виден верхний SPB, тогда как сегменты нижнего SPB только видны. Микротрубочки
зародыши обоих SPB четко видны, и биполярное веретено очевидно. ( Правая панель ) Второе репрезентативное веретено из клетки clb1Δ clb2-VI при 37 ° C.Биполярный шпиндель, исходящий из двух отдельных SPB, хорошо виден (хотя только один SPB содержался
в этой секции).

Чтобы идентифицировать важную функцию (и) Clb1 / 2-CDK, мы исследовали фенотип клеток clb1Δ clb2-VI , претерпевающих синхронный клеточный цикл при 37 ° C.Клетки дикого типа и clb1Δ clb2-VI были задержаны в G1 с помощью феромона α-фактора (при комнатной температуре) и затем выпущены в клеточный цикл при 37 ° C. Дикого типа
клетки прогрессировали через метафазу через 90 минут после высвобождения, переходили в анафазу через 105 минут и выходили из митоза через 120 минут после
выпуск из блока G1 (рис. 1Б). В соответствии с предыдущими исследованиями (Сурана и др., 1991; Фитч и др., 1992; Ричардсон и др., 1992), мы обнаружили, что клетки в культурах clb1Δ clb2-VI накапливались с короткими биполярными веретенами и неразделенными ядрами (рис.1Б, В). Микроскопия живых клеток подтвердила этот результат. Во время визуализации живых клеток мы определили начало анафазы как момент времени после
удлинение метафазных веретен (длиной не менее 2 мкм) наблюдалось, по меньшей мере, в четырех последовательных временных точках. Используя это
Согласно критерию, клетки дикого типа вошли в анафазу через 24,3 мин после отделения SPB (SD = 14,1; n = 8) (пример показан на фиг. 1D; дополнительный ролик 1). В клетках clb1Δ clb2-VI вступление в анафазу не происходило до 47.Через 4 мин после отделения SPB (SD = 16,4; n = 8) (пример показан на рис. 1D; дополнительный ролик 2). Это различие было очень значимым ( P = 0,009; двусторонний тест Стьюдента t -тест).

Анализ фиксированных клеток с использованием непрямой иммунофлуоресценции in situ показал, что только несколько клеток clb1Δ clb2-VI вошли в анафазу (фиг. 1B). Вместо этого разборка шпинделя произошла в более поздние моменты времени, что указывает на полную деактивацию CDK и, следовательно, выход из
митоз в конечном итоге происходит в клетках clb1Δ clb2-VI .Однако важно отметить, что выход из митоза существенно задерживается в клетках clb1Δ clb2-VI , потому что они подвергаются разборке веретена по крайней мере через 45 минут после клеток дикого типа (Fig. 1B). При анализе живых клеток клетки clb1Δ clb2-VI вели себя несколько иначе. После задержки большинство клеток удлинили свои веретена и завершили анафазу (Fig. 1D; Supplemental Movie 2). Причина такой разницы в поведении в настоящее время неизвестна. Тем не менее ясно, что под
В обоих условиях анализа начало удлинения веретена анафазы было нарушено в клетках clb1Δ clb2-VI .

Ультраструктурный анализ коротких биполярных веретен, наблюдаемых в клетках clb1Δ clb2-VI , показал, что они напоминают клетки дикого типа (рис. 1E; см. Winey et al. 1995, для изображения короткого биполярного веретена дикого типа в котором видны оба SPB). Делаем вывод, что биполярные шпиндели
образованные clb1Δ clb2-VI клетки имеют нормальный внешний вид, по крайней мере, на уровне электронной микроскопии, и что CLB1 и CLB2 необходимы для деления ядра.

Дефект митотической прогрессии клеток clb1Δ clb2-VI не зависит от ингибирующего фосфорилирования Tyr19 на Cdc28

У почкующихся дрожжей формирование веретена происходит во время S-фазы. Таким образом, невозможно узнать, происходит ли остановка / задержка клеточного цикла
характеризуется короткими биполярными веретенами, что отражает дефект G2 или метафазы.Задержки G2 могут быть вызваны фосфорилированием Cdc28.
на Tyr19, который катализируется ортологом Saccharomyces cerevisiae киназы Wee1, Swe1 (Mendenhall and Hodge, 1998). Swe1, как было установлено, блокирует клетки в G2 в ответ на активацию контрольной точки морфогенеза (для обзора см. Keaton and Lew 2006). Мы инактивировали SWE1 или использовали аллель CDC28 , устойчивый к фосфорилированию Tyr19, cdc28Y19F , чтобы проверить, может ли фосфорилирование Tyr19 объяснять задержку клеточного цикла клеток clb1Δ clb2-VI .Инактивация SWE1 не влияла на развитие клеточного цикла клеток clb1Δ clb2-VI (фиг. 2A). Идентичные результаты были получены с аллелем cdc28Y19F (дополнительный рисунок 2). Следовательно, накопление клеток с короткими биполярными веретенами в культурах clb1Δ clb2-VI нельзя отнести к стойкому фосфорилированию Y19.

Фигура 2.

Активность Clb1 / 2-CDK необходима при переходе от метафазы к анафазе, чтобы вызвать вход в анафазу. ( A ) Клетки дикого типа (A1411), swe1 Δ (A7507), clb1Δ clb2-VI (A3000) и swe1Δ clb1Δ clb2-VI (A15936) клетки, каждая из которых несла Cdc14-3HA. выращены и проанализированы, как показано на рисунке 1B. ( Верхняя панель ) Процент клеток с метафазными веретенами. ( Нижняя панель ) Процент клеток с анафазными веретенами.( B ) pMET3-CDC20 (A7334) и pMET3-CDC20 Клетки clb1Δ clb2-VI Pds1-13Myc (A15112) выращивали в полной синтетической среде (CSM), не содержащей метионина, и задерживали в G1 с помощью α-фактора. (5
мкг / мл) в течение 2,5 ч при комнатной температуре. Клетки промывали 10 об. CSM и помещали при комнатной температуре в среду, не содержащую α-фактора.
CSM, содержащий 4 мМ метионина, чтобы останавливать клетки в метафазе. Через 2,5 ч в метионине клетки переводили при 37 ° C на 1 ч.
инактивировать активность Clb2-VI-CDK в метафазе.Затем клетки высвобождали в CSM без метионина при 37 ° C для восстановления экспрессии CDC20 при сохранении инактивации Clb2-VI-CDK. Пятнадцать процентов клеток входят в анафазу в присутствии
метионин при сдвиге температуры до 37 ° С. Мы полагаем, что это происходит из-за вызванной температурой временной дерепрессии промотора MET3 .

Активность Clb1 / 2 – CDK необходима во время метафазы для продвижения анафазы.

Наши эксперименты показывают, что активность Clb1 / 2-CDK необходима в точке между переходом G1 / S и метафазой для анафазы.
удлинение шпинделя.Чтобы определить, требуются ли комплексы Clb1 / 2-CDK во время метафазы для обеспечения входа в анафазу, мы
исследовали эффект инактивации этих комплексов CDK во время метафазы. Клетки могут быть обратимо арестованы в метафазе с помощью
помещение CDC20 под контроль репрессируемого метионином промотора MET3 (Uhlmann et al. 2000). Мы остановили pMET3 CDC20 и pMET3 CDC20 clb1Δ clb2-VI клетки в метафазе добавлением метионина, а затем инактивировали Clb2-VI-CDK, переведя клетки в температуру 37 ° C.Когда> 80%
клетки были задержаны в метафазе, их высвобождали в среду без метионина при 37 ° C для поддержания инактивации Clb2-VI.
После удаления метионина экспрессия CDC20 быстро восстанавливалась, и клетки pMET3-CDC20 переходили в анафазу (фиг. 2B). Напротив, вступление в анафазу не происходило в клетках pMET3 CDC20 clb1Δ clb2-VI (фиг. 2B). Таким образом, активность Clb1 / 2-CDK необходима во время метафазы, чтобы вызвать вхождение в анафазу.

Активность Clb1 / 2 – CDK необходима для деградации секурина.

Деградация Securin / Pds1 отмечает переход в анафазу. Чтобы определить, требуется ли активность Clb1 / 2-CDK для деградации Securin / Pds1,
мы исследовали уровни Securin / Pds1 в клетках clb1Δ clb2-VI . После высвобождения из блока G1 при 37 ° C клетки дикого типа инициировали деградацию Securin / Pds1 и вход в анафазу.
Через 105 мин после выхода из ареста (рис.3А). clb1Δ clb2-VI клетки, однако, существенно задерживаются в деградации Securin / Pds1 (Fig. 3A), указывая тем самым, что активность Clb1 / 2-CDK необходима для деградации Securin / Pds1.

Рисунок 3.

clb1Δ clb2-VI клетки дефектны в деградации секурина. ( A ) Клетки дикого типа, несущие Pds1-HA (A1015) и clb1Δ clb2-VI. Клетки , несущие Pds1-HA и Scc1-18Myc (A15111), выращивали и обрабатывали, как показано на Фигуре 1B.Определяли процент клеток с метафазными и анафазными веретенами (график) и проверяли уровни белка Pds1-HA.
методом вестерн-блоттинга. Pgk1 использовали в качестве контроля загрузки в Вестерн-блоттинге. ( B ) mad1Δ rad9 Δ (A15999), clb1Δ clb2-VI (A15111) и mad1Δ rad9Δ clb1Δ clb2-VI (A16000) клетки, каждая из которых несла Pds1-HA и Scc1-18Myc и рассматривается как на рисунке 1B. Процент клеток с метафазным ( левый график ) и анафазным ( правый график) веретенами, а также количество полноразмерных Scc1-18Myc (Scc1 *), C-концевого фрагмента расщепления Scc1-18Myc (расщепленного
Scc1) и Pds1-HA.Pgk1 использовали в качестве контроля загрузки в Вестерн-блоттинге.

Известно, что два механизма наблюдения, контрольные точки повреждения ДНК и сборки веретена предотвращают APC / C – Cdc20-опосредованную
деградация Securin / Pds1. Чтобы проверить, вызвана ли стабилизация Securin / Pds1 в клетках clb1Δ clb2-VI активацией любой из контрольных точек, мы исследовали эффекты удаления компонентов обоих наблюдений.
механизмы деградации Securin / Pds1 и прогрессирования клеточного цикла в клетках clb1Δ clb2-VI . RAD9 и MAD1 были удалены, чтобы инактивировать повреждение ДНК и контрольную точку сборки веретена, соответственно. В клетках mad1Δ rad9 Δ деградация Securin / Pds1 через 90 мин совпадала с образованием продукта расщепления Scc1 / Mcd1 и
появление анафазных веретен (рис. 3Б). В штаммах clb1Δ clb2-VI происходит деградация Securin / Pds1, образование продукта расщепления Scc1 / Mcd1 и появление анафазных веретен.
были сильно задержаны (рис.3Б). Деградация Securin / Pds1 аналогичным образом задерживалась в mad1Δ rad9Δ clb1Δ clb2-VI (фиг. 3B). Важно отметить, что задержка удлинения анафазного веретена параллельна задержке расщепления Scc1 / Mcd1, демонстрируя, что веретено
морфология точно отражает развитие клеточного цикла клеток clb1Δ clb2-VI .

Наши данные показывают, что клетки, лишенные активности Clb1 / 2-CDK, дефектны в нацеливании на Securin / Pds1 для деградации и, следовательно,
не могут полностью активировать разделение.Этот дефект не зависит от контрольных точек, которые, как известно, контролируют это событие.
и, таким образом, может отражать прямую роль активности Clb1 / 2-CDK в активации APC / C-Cdc20. Чтобы проверить эту идею, мы исследовали эффекты
высоких уровней Cdc20 на деградацию Securin / Pds1 и расщепление когезина в клетках clb1Δ clb2-VI . Сверхэкспрессия CDC20 из промотора GAL1-10 частично устраняет задержку деградации Securin / Pds1 и расщепления когезина в клетках clb1Δ clb2-VI .В условиях, когда промотор GAL1-10 неактивен (рафиноза), клетки pGAL-CDC20 инициировали расщепление когезина по крайней мере за 60 минут до клеток pGAL-CDC20 clb1Δ clb2-VI (фиг. 4A). Напротив, когда Cdc20 был сверхпродуцирован (рафиноза + галактоза), задержка деградации Securin / Pds1 и расщепления когезина
был менее выражен (рис. 4А). Это наблюдение предоставляет дополнительные доказательства того, что APC / C гипоактивен в отсутствие активности Clb1 / 2-CDK.

Рисунок 4.

Активность Clb1 / 2 – CDK управляет входом в анафазу несколькими способами. ( A ) Штаммы дикого типа (A16651) и clb1Δ clb2-VI (A16580), каждый из которых несет Pds1-HA, Scc1-18Myc и три копии pGAL-CDC20 в локусе URA3 , были арестован α-фактором (5 мкг / мл) в среде YEP, содержащей 2% рафинозы (YEPR) для 2.5 ч при комнатной температуре.
Затем клетки промывали 10 об. YEP и помещали в предварительно нагретый YEPR при 37 ° C. Культуры сразу же разделили.
в двух, и галактозу (2%) добавляли к одной из двух культур. Уровни белка Scc1-18Myc и Pds1-HA контролировали во время
клеточный цикл. Pgk1 использовался в качестве контроля загрузки. Блот для Pds1-HA в среде с рафинозой взят из пленки, экспонированной на 2,5 мин.
в то время как блот Pds1-HA в среде с галактозой получен в результате воздействия в течение ночи.Ночное воздействие потребовалось, потому что Pds1-HA
уровни очень низкие у штаммов, которые сверхэкспрессируют CDC20 . Все блоты Scc1-18Myc получены в результате ночного воздействия. Все блоты Pgk1 получены с 2,5-минутных экспозиций. ( B ) Схематическая диаграмма пути, регулирующего переход метафаза-анафаза. ( C – F ) дикого типа (A3160), pds1 Δ (A2015), clb1Δ clb2-VI Pds1-HA (A15111) и clb1Δ clb2-VI pds1 Δ (A15840), каждый из которых несет a Scc1-18Myc слияния, были арестованы в G1, как показано на рисунке 1B.Затем клетки выпускали в YEPD, содержащий 10 мг / мл HU, для остановки клеток в S-фазе при комнатной температуре (RT). Этот шаг
необходимо, потому что pds1 Δ клетки имеют чувствительный к температуре дефект на переходе G1 / S, который, вероятно, связан с нарушением накопления Separase / Esp1
в ядре при 37 ° C (Yamamoto et al. 1996a, b; Agarwal and Cohen-Fix 2002). После 75 мин в HU клетки тщательно промывали и ресуспендировали в YEPD без HU при комнатной температуре.Колбы были
затем помещали в водяную баню с 30 ° C, и водяную баню затем устанавливали на 37 ° C. Мы обнаружили, что этот ступенчатый температурный сдвиг приводит к
наиболее синхронный выпуск из блока HU в 37 ° C YEPD. Момент времени 0 минут был взят до того, как клетки были освобождены от
блок HU. ( D ) Процент клеток с метафазоподобными веретенами. Веретена были классифицированы как метафазные, потому что метафазные, как определено
2N клетками с биполярным веретеном, содержащим Securin / Pds1 и нерасщепленный когезин, не встречается в клетках pds1 Δ.( E ) Процент клеток с анафазными веретенами. ( F ) Расщепление когезина отслеживали, исследуя количество полноразмерного Scc1-18Myc (Scc1 *) и C-концевого фрагмента расщепления.
Scc1-18Myc (расщепленный Scc1). Блоты Scc1-18Myc из штаммов pds1 Δ, высвобожденных из HU, последовательно демонстрируют белок массой 90 кДа, который перекрестно реагирует с антителом Myc, идентичность которого
неизвестно. Pgk1 использовали в качестве контроля загрузки в Вестерн-блоттинге.

clb1Δ clb2-VI клетки дефектны по удлинению веретена в отсутствие PDS1

Наши данные показывают, что clb1Δ clb2-VI клетки являются дефектными в деградации Securin / Pds1. Если этот дефект был единственно ответственным за задержку метафазы клеток clb1Δ clb2-VI , делеция PDS1 должна устранить дефект входа в анафазу клеток clb1Δ clb2-VI (рис.4Б). Мы использовали расщепление когезином (Scc1 / Mcd1), чтобы проследить вступление анафазы в клетки pds1 Δ. Клетки дикого типа, pds1, Δ, clb1Δ clb2-VI, и pds1Δ clb1Δ clb2-VI , были арестованы в ранней S-фазе с помощью гидроксимочевины (HU) при 25 ° C (рис. 4C), чтобы обеспечить достаточное накопление Разделите / Esp1 в ядре pds1 Δ клеток (Yamamoto et al. 1996a, b; Agarwal and Cohen-Fix 2002). После высвобождения из блока S-фазы при 37 ° C расщепление когезина задерживалось в клетках clb1Δ clb2-VI (рис.4F). Напротив, расщепление cohesin происходит преждевременно в клетках, лишенных PDS1 (фиг. 4F). clb1Δ clb2-VI Клетки без PDS1 демонстрировали такое же преждевременное расщепление когезина, что и одиночный мутант pds1 Δ (рис. 4F), что указывает на то, что неспособность расщепить Pds1, вероятно, была единственной причиной задержки расщепления когезина в клетках clb1Δ clb2-VI .

Мы также исследовали эффекты удаления PDS1 на развитие клеточного цикла.Клетки дикого типа и pds1 Δ прогрессировали из метафазы в анафазу со сходной кинетикой (рис. 4D, E). Напротив, клетки clb1Δ clb2-VI задерживались при входе в анафазу (фиг. 4D, E). Неожиданно, делеция PDS1 не ускоряла удлинение веретена в клетках clb1Δ clb2 VI (фиг. 4D, E). Следовательно, клетки clb1Δ clb2-VI имеют дефект входа в анафазу, который не зависит от стабилизации Securin / Pds1 и расщепления когезина.Последовательный
с этой идеей — открытие, что избыточное производство CDC20 , несмотря на частичное восстановление дефекта расщепления когезина в этом штамме, не смогло спасти дефект удлинения веретена
clb1Δ clb2-VI клеток (данные не показаны).

Инактивация когезина не подавляет дефект удлинения веретена клеток clb1Δ clb2-VI

Было показано, что у почкующихся дрожжей расщепление субъединицы Scc1 / Mcd1 когезинового комплекса необходимо и достаточно для
удлинение веретена анафазы (Uhlmann et al.2000). В клетках, несущих мутантную форму когезина, которая содержит целевой сайт для протеазы TEV, экспрессия протеазы TEV
достаточно, чтобы вызвать сегрегацию хромосом, таким образом обходя требование APC / C – Cdc20 или Separase / Esp1 в запуске
удлинение веретена (Uhlmann et al. 2000). Точно так же термочувствительные аллели SCC1 / MCD1 ( mcd1-1 или scc1-73 ) допускают удлинение веретена и разделение сестринских хроматид в отсутствие активации Separase / Esp1 (рис.4B; Guacci et al. 1997; Северин и др. 2001b). Если неспособность клеток clb1Δ clb2-VI образовывать веретена анафазы была связана с неспособностью запускать расщепление Scc1 / Mcd1, инактивация когезинов должна вызывать
удлинение шпинделя (рис. 4В). Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали термочувствительный аллель mcd1-1 , который, как было показано ранее, обходит остановку метафазы клеток, лишенных активности APC / C-Cdc20 (Guacci et al. 1997).

Инактивация когезии сестринских хроматид вызывает активацию контрольной точки сборки веретена, потому что кинетохора – микротрубочка
привязанности, которые не находятся под напряжением, быстро разрываются (Biggins and Murray 2001; Tanaka et al.2002; Dewar et al. 2004 г.). Чтобы избежать косвенного влияния активации контрольной точки шпинделя на кинетику удлинения шпинделя, мы удалили шпиндель.
Компонент КПП MAD1 . После выхода из блока G1 при 37 ° C все штаммы вступали в митоз со сходной кинетикой, о чем судили по формированию биполярного веретена.
(Рис. 5B). Неожиданно оказалось, что клетки mcd1-1 clb1Δ clb2-VI не смогли удлинить веретено до такой степени, как это было у клеток mcd1-1 , о чем судили по измерениям длины веретена (рис.5B; Дополнительный рис. 3A). Через 105 мин после высвобождения из G1 клетки mcd1-1 демонстрируют широкое распределение длин веретена с модой на 8-10 мкм. Клетки clb1Δ clb2-VI проявляли моду при 2-4 мкм (фиг. 5C; дополнительная фиг. 3A). Распределение длин веретена в клетках mcd1-1 clb1Δ clb2-VI было немного шире, чем у клеток clb1Δ clb2-VI , и составляло 4-6 мкм (рис. 5C; дополнительный рис. 3A).

Рисунок 5.

Clb1 / 2-CDK активность необходима после расщепления cohesin, чтобы вызвать удлинение веретена анафазы. ( A – C ) mcd1-1 mad1 Δ (A2784), clb1Δ clb2-VI mad1 Δ Pds1-13Myc (A14770) и mcd1-1 mad1Δ clb1Δ clb2-VI 62 Pds14-13Myc клетки, каждая из которых несет слияние Cdc14-3HA, были арестованы в G1 при комнатной температуре и выпущены в 37 ° C.
YEPD, как показано на рисунке 1B. MAD1 был удален в каждом штамме, потому что мутанты когезина запускают контрольную точку сборки веретена (Severin et al.2001b). ( A ) Морфология микротрубочек и ДНК показана через 105 мин после высвобождения из G1. Микротрубочки показаны зеленым цветом, а ДНК показана
в синем. Веретена оказались хрупкими в клетках mcd1-1 mad1 Δ и mcd1-1 mad1Δ clb1Δ clb2-VI . Это происходит из-за преждевременного разделения сестринских хроматид, что приводит к чрезвычайно коротким микротрубочкам кинетохор.
( B ) Процент клеток с биполярными веретенами ( левый график ) и средняя длина веретена каждого штамма ( правый график ) были определены в указанные моменты времени ( n = 100 веретен на 75 мин и 90 мин, n = 80 шпинделей за 105 мин, и n = 70 шпинделей за 120 мин).(*) MAD1 был удален в каждом штамме, чтобы предотвратить активацию контрольной точки сборки шпинделя. Эти временные точки были выбраны потому, что
у них был самый высокий процент клеток с биполярным веретеном. Графики длины веретена в виде ящика и уса из этого эксперимента.
показаны на дополнительном рисунке 3A. ( C ) Распределение длин веретена mcd1-1 mad1 Δ, clb1Δ clb2-VI mad1 Δ и mcd1-1 clb1Δ clb2-VI mad1 Δ клеток через 105 мин после высвобождения из G1 ( n = 80 шпинделей).Временная точка 105 минут была выбрана потому, что в ней был самый высокий процент клеток с биполярным веретеном. ( D , E ) Покадровая серия удлинения веретена в клетках mcd1-1 mad1 Δ (A17974) и mcd1-1 clb1Δ clb2-VI mad1 Δ (A17977), каждая из которых несет Tub1-GFP и Cdc14-3HA расплавы. Клетки были подготовлены для визуализации, как описано на рисунке 1D и в материалах и методах. Время * относится ко времени после отделения SPB с 0, определенным как первая временная точка, в которую
Видно отделение СПБ.( D ) Расстояние между двумя разделенными SPB в каждой ячейке измеряли в каждый момент времени, когда веретено было в фокусе.
Показаны mcd1-1 clb1Δ clb2-VI mad Δ клетки A (дополнительный фильм 4) и B, C и D (дополнительный фильм 5), поскольку они представляют диапазон шпинделя.
фенотипы элонгации, наблюдаемые в клетках mcd1-1 clb1Δ clb2-VI mad1 Δ. ( E , верхняя панель ) Покадровая серия Δ-клетки mcd1-1 mad1 , проходящей анафазу (показана в дополнительном фильме 3).Эта ячейка была выбрана потому, что она инициировала анафазу примерно в то же время
к среднему времени наступления анафазы популяции mcd1-1 mad1 Δ. ( Нижняя панель ) Покадровая серия клеток mcd1-1 clb1Δ clb2-VI mad1 Δ, претерпевающих анафазу (показана в дополнительном фильме 4). Эта ячейка была выбрана потому, что она инициировала анафазу примерно в то же время
к среднему времени наступления анафазы популяции mcd1-1 clb1Δ clb2-VI mad1 Δ.

Анализ живых клеток

также показал, что клетки clb1Δ clb2-VI mcd1-1 не смогли удлинить свои веретена. mcd1-1 клетки достигли длины веретена 4 мкм, в среднем 29,9 мин (SD = 14,2; n = 14) после отделения SPB (рис. 5D, E; дополнительный ролик 3), и только пять из 28 клетки не смогли удлинить свои веретена (данные не показаны).Напротив, в
mcd1-1 clb1Δ clb2-VI , удлинение веретена либо не происходило вообще (шесть из 16 клеток) (т. Е. Клетка D на рис. 5D; дополнительный ролик 5), либо происходило с задержкой (48,6 мин после SPB разделение; SD = 14,3; n = 9; обратите внимание, что клетки, которые не смогли удлинить свои веретена, не были включены в этот расчет) (рис. 5D, E; дополнительные фильмы 4, 5). Задержка начала анафазы была более вариабельной в клетках clb1Δ clb2-VI , лишенных сцепления сестринских хроматид, чем в клетках clb1Δ clb2-VI , но разница между клетками mcd1-1 и mcd1-1 clb1Δ clb2-VI тем не менее был очень значимым ( P = 0.006; двусторонний Стьюдент т -тест). Поведение веретена у клеток clb1Δ clb2-VI , лишенных когезии, также было более сложным, чем у клеток clb1Δ clb2-VI со связями сестринских хроматид. Митотические веретена прошли непрерывные циклы растяжения до длины между
3 и 4 мкм, схлопывание и преобразование (дополнительные видеоролики 4, 5). Мы заключаем, что потеря когезинов не полностью восстановила
удлинение веретена до clb1Δ clb2-VI клеток, указывая на то, что активность Clb1 / 2-CDK необходима для удлинения веретена анафазы независимо от удаления когезина.Кроме того, дефект деградации Securin / Pds1 в клетках clb1Δ clb2-VI способствует их фенотипу короткого веретена, поскольку при инактивации наблюдается сдвиг в сторону большей длины веретена.
сцепления с аллелем mcd1-1 .

Активность Clb1 / 2 – CDK необходима для удлинения шпинделя в анафазе

Неспособность аллеля mcd1-1 восстанавливать элонгацию веретена в клетках clb1Δ clb2-VI указывает на то, что комплексы Clb1 / 2-CDK выполняют дополнительные функции по стимулированию сегрегации хромосом, которые отличаются друг от друга.
от их роли в стимулировании активации комплекса APC / C – Cdc20.Что это за дополнительные функции? Clb1 / 2 – активность CDK могла
необходимы либо для разрешения cohesin-независимых связей между сестринскими хроматидами, либо для обеспечения удлинения анафазного веретена.

Чтобы проверить возможность того, что отсутствие активности Clb1 / 2-CDK запускает аберрантные формы сцепления сестринских хроматид, которые
независимы от сплоченности или для разрешения часто встречающихся форм сестринских хроматидных связей, таких как катенации, мы исследовали
как полное отсутствие сестринской хроматиды влияет на удлинение веретена в клетках clb1Δ clb2-VI .Cdc6 является важным компонентом пререпликативных комплексов (pre-RCs) (Toone et al. 1997). Штаммы, несущие CDC6 под контролем глюкозо-репрессируемого промотора GAL1-10 , не могут реплицировать свою ДНК в присутствии глюкозы (Piatti et al. 1995; Biggins and Murray 2001; Stern and Murray 2001; Tanaka et al. 2002). Чтобы избежать косвенного воздействия активации контрольной точки шпинделя на кинетику удлинения шпинделя, когда CDC6 истощается, мы удалили компонент контрольной точки шпинделя MAD1 (Stern and Murray 2001).После высвобождения из вызванного феромоном ареста G1 при 37 ° C репликация ДНК в значительной степени блокировалась в клетках pGAL-CDC6 и pGAL-CDC6 clb1Δ clb2-VI , но не в клетках clb1Δ clb2-VI (дополнительный рисунок 4). ). Клетки pGAL-CDC6 постепенно удлиняли свои веретена, в то время как клетки clb1Δ clb2-VI клетки оставались короткими (фиг. 6B; дополнительный фиг. 3B). Клетки pGAL-CDC6 clb1Δ clb2-VI не смогли удлинить свои веретена до длины, наблюдаемой в клетках pGAL-CDC6 , и веретена имели характерный хрупкий вид веретен с короткими кинетохорными микротрубочками (рис.6А, В; Дополнительный рис. 3B). Измерения длины веретена через 90 мин после выхода из G1 показали, что 43% клеток в
pGAL-CDC6 Культуры содержали веретена> 6 мкм, в то время как только 2% клеток clb1Δ clb2-VI и 10% клеток pGAL-CDC6 clb1Δ clb2-VI содержали веретена такой длины (фиг. 6C; дополнительная фиг. . 3B). Мы пришли к выводу, что неразрешенные связи сестринских хроматид не могут объяснить дефект удлинения веретена.
clb1Δ clb2-VI клеток.

Рисунок 6.

clb1Δ clb2-VI клетки дефектны по удлинению веретена анафазы. ( A – C ) mad1Δ cdc6Δ pGAL-Ubi-R-CDC6 Pds1-18Myc (A15078), mad1Δ clb1Δ clb2-VI Pds1-13Myc Cdc14-3HA (A14770) и mad1Δ cdAL-IΔ- Клетки R-CDC6 clb1Δ clb2-VI Pds1-18Myc (A15334) выращивали в YEP-рафинозе + галактозе (YEPRG) при комнатной температуре и задерживали в G1 с помощью α-фактора.
(5 мкг / мл) в течение 3 ч.Клетки высвобождали в YEPRG без α-фактора при комнатной температуре и через 20 мин добавляли глюкозу в
репрессировать pGAL-CDC6 . Глюкозу добавляли через 20 минут, чтобы дать клеткам достаточно времени для накопления достаточного количества Cdc6 для одного клеточного цикла. α-фактор был
снова добавляли через 75 мин после высвобождения для остановки клеток в G1 следующего клеточного цикла, в то время как pGAL-CDC6 репрессировался. Спустя двести двадцать пять минут после добавления α-фактора (всего 3 часа) клетки высвобождались из второй
Блокировка G1 в YEPD при 37 ° C.( A ) Морфология микротрубочек и ДНК показана через 90 минут после высвобождения из G1. Микротрубочки показаны зеленым цветом, а ДНК показана
в синем. ( B ) Процент клеток с биполярным веретеном ( верхний график, ) и средняя длина веретена каждого штамма ( нижний график ) определяли в указанные моменты времени (по меньшей мере 100 клеток исследовали в каждый момент времени). Эти временные точки были выбраны
потому что у них был самый высокий процент клеток с биполярным веретеном.Графики длины шпинделя в виде ящика и уса из этого
Эксперимент показан на дополнительном рисунке 3B. ( C ) Показано распределение длин шпинделей через 90 мин после высвобождения из G1 (было измерено не менее 100 шпинделей). 90-е
Временная точка min была выбрана потому, что в ней был самый высокий процент клеток с биполярным веретеном. ( D – F ) ndc10-1 (A2733), clb1Δ clb2-VI (A3000) и ncd10-1 clb1Δ clb2-VI (A15260), каждый из которых несет слияние Cdc14-3HA. в YEPD при комнатной температуре и обрабатывали, как описано на рисунке 1B.( D ) Морфология микротрубочек и ДНК показана через 120 мин после высвобождения из ареста G1. Микротрубочки показаны зеленым цветом, а
ДНК показана синим цветом. ( E ) Процент клеток с биполярным веретеном ( верхний график ) и средняя длина веретена каждого штамма ( нижний график ) определяли в указанные моменты времени (по меньшей мере 100 клеток исследовали за один момент времени). Эти временные точки были выбраны
потому что у них был самый высокий процент клеток с биполярным веретеном.Графики длины шпинделя в виде ящика и уса из этого
Эксперимент показан на дополнительном рисунке 3C. ( F ) Показано распределение длин шпинделя через 120 мин после выхода из G1 ( n = 100 шпинделей). Временная точка 120 мин была выбрана потому, что в ней был самый высокий процент клеток с биполярным веретеном.

Наши данные показывают, что активность Clb1 / 2 – CDK необходима для образования анафазного веретена независимо от сестринской хроматиды.
cohesion и предполагают, что активность Clb1 / 2-CDK необходима для удлинения веретена.Чтобы проверить эту гипотезу более прямо, мы
спросили, необходима ли активность Clb1 / 2-CDK для преждевременного удлинения веретена, которое происходит у некоторых мутантов кинетохор. Кинетохора
мутанты были исследованы, потому что прикрепление веретена к кинетохорам обычно сдерживает удлинение веретена до анафазы (из-за
к сцеплению сестринских хроматид). В клетках, несущих термочувствительный аллель гена NDC10 ( ndc10-1 ), который кодирует интегральный кинетохорный компонент, удлинение веретена не связано с развитием клеточного цикла (Goh and Kilmartin 1993).При ограничительной температуре клетки ndc10-1 преждевременно удлиняют свои веретена без расщепления хромосом (поскольку хромосомы не прикреплены к микротрубочкам).
митотического веретена) (Fig. 6D; Goh and Kilmartin 1993; Ciosk et al. 1998; Tavormina and Burke 1998; Fraschini et al. 2001). После освобождения от остановки G1 при 37 ° C клетки ndc10-1 , clb1Δ clb2-VI и ndc10-1 clb1Δ clb2-VI собрали биполярные веретена со сходной кинетикой (рис.6E). Мутантные клетки ndc10-1 удлиняли свои веретена в отсутствие деления ядра, о чем судили по окрашиванию DAPI, что указывает на то, что
Аллель ndc10-1 был инактивирован (фиг. 6D). Неожиданно оказалось, что средняя длина веретена клеток ndc10-1 clb1Δ clb2-VI была существенно короче, чем у клеток ndc10-1 во все исследованные моменты времени (фиг. 6E; дополнительный фиг. 3C). Спустя сто двадцать минут после выхода из блока G1 длины шпинделя были широко распределены
от 3 до 12 мкм у мутантов ndc10-1 (рис.6F; Дополнительный рис. 3C). Напротив, длина веретена составляла от 0 до 6 мкм в клетках clb1Δ clb2-VI и ndc10-1 clb1Δ clb2-VI (фиг. 6F; дополнительный фиг. 3C). Мы заключаем, что активность Clb1 / 2-CDK необходима для удлинения анафазного веретена. Поскольку у мутантов ndc10-1 отсутствуют микротрубочки, связывающие кинетохоры с митотическим веретеном, мы предполагаем, что необходима активность Clb1 / 2-CDK.
для анафазы B, которая представляет собой удлинение микротрубочек полюс-полюс.

Активность Clb2 / 3 – CDK необходима для деградации Securin / Pds1 и удлинения веретена в анафазе.

Наблюдается ли дефект входа в анафазу в клетках clb1Δ clb2-VI , специфичный для этой конкретной комбинации мутантов циклина CLB , или комбинированная инактивация других циклинов CLB также вызывает дефекты входа в анафазу? Чтобы ответить на этот вопрос, мы сначала изучили последствия отключения
все CDK на митотической прогрессии с использованием чувствительного к аналогу АТФ аллеля CDC28 ( cdc28-as1 ) (Bishop et al.2000). Клетки, несущие аллель cdc28-as1 в качестве единственного источника CDC28 , высвобождались из индуцированного феромоном ареста G1, и ингибитор был добавлен до митоза (65 мин после высвобождения), когда клетки
вошел в метафазу (95 мин после высвобождения) и когда клетки были в анафазе (120 мин после высвобождения). В соответствии с предыдущими
данные, показывающие, что активность Clb-CDK необходима для поддержания митотического веретена (Fitch et al. 1992; Richardson et al.1992; Amon et al. 1993; Бишоп и др. 2000), коллапс веретена произошел вскоре после добавления ингибитора, независимо от того, на какой стадии клеточного цикла находились клетки (Supplemental
Рис.5). Таким образом, минимальное количество активности Clb-CDK необходимо для поддержания митотического веретена.

Чтобы определить, вызывает ли комбинированная инактивация других циклинов CLB дефекты входа в анафазу, мы объединили делецию CLB3 с термочувствительным аллелем clb2-VI .Инактивация CLB2 и CLB3 , как и делеция CLB1 и CLB2 , является летальной (Fitch et al. 1992; Richardson et al. 1992), что указывает на существенную потребность в этой паре циклинов в развитии клеточного цикла. Кроме того, мы изучили последствия
инактивации CLB1 , CLB2 и CLB3 с использованием тройного мутанта clb1Δ clb2-VI clb3 Δ. После высвобождения клеток из индуцированного феромоном G1 ареста при 37 ° C, clb2-VI clb3 Δ и clb1Δ clb2-VI clb3 Δ клетки, но не clb1Δ clb2-VI клетки, показали 30- и 40 -мин задержка формирования биполярного веретена соответственно (рис.7Б). Это наблюдение согласуется с предыдущим выводом о том, что активность Clb-CDK необходима для формирования биполярного веретена.
(Фитч и др., 1992; Ричардсон и др., 1992).

Рисунок 7.

clb2-VI clb3 Δ клетки являются дефектными в деградации секурина и удлинении веретена анафазы. ( A , B ) Клетки дикого типа (A1951), clb1Δ clb2-VI (A15111), clb2-VI clb3 Δ (A19136) и clb1Δ clb2-VI clb3 Δ (A1938) , каждый несущий Pds1-HA и Scc1-18Myc, выращивали и обрабатывали, как описано на Фигуре 1B.( A ) Количества полноразмерного Scc1-18Myc (Scc1-18Myc *), C-концевого фрагмента расщепления Scc1-18Myc (расщепленного Scc1) и
Также исследовали Pds1-HA. Pgk1 использовали в качестве контроля загрузки в Вестерн-блоттинге. ( B ) Процент клеток с метафазным ( левый график ) и анафазным ( правый график) веретенами определяли в указанные моменты времени. ( C – E ) ndc10-1 (A2733), clb2-VI clb3 Δ (A2887), ncd10-1 clb2-VI clb3 Δ (A19288) и ncd10-1 clb1Δ clb2-VI (A17126), каждый из которых несет слитый Cdc14-3HA, выращивали и обрабатывали, как описано на Фигуре 1B.Процент клеток с биполярным веретеном показан в C ( n = 200). На графике, показанном в D , моменты времени были скорректированы таким образом, чтобы начало формирования биполярного веретена происходило одновременно. Выбранные моменты времени
для анализа отмечены черным кружком. Для штамма ndc10-1 момент времени 0 в D соответствует 45-минутному моменту времени в C ; для штамма ncd10-1 clb1Δ clb2-VI момент времени 0 соответствует 75-минутному моменту времени в C ; для штаммов clb2-VI clb3 Δ и ncd10-1 clb2-VI clb3 Δ 0-минутные моменты времени соответствуют 90-минутным временным точкам в C .Задержка сборки биполярного веретена в штамме ncd10-1 clb1Δ clb2-VI по сравнению со штаммом ndc10-1 не воспроизводится и не характерна для этого мутанта. ( E ) Средняя длина веретена каждой деформации. Моменты времени соответствуют моментам времени в D , отмеченным черным кружком. За один момент времени исследовали не менее 140 клеток. Ящички и усы длин шпинделя от
этот эксперимент показан на дополнительном рисунке 3D.

Мы проследили за развитием клеточного цикла у этих штаммов и обнаружили, что комбинированная функция CLB2 и CLB3 также необходима для входа в анафазу. Подобно клеткам clb1Δ clb2-VI , клетки clb2-VI clb3 Δ и clb1Δ clb2-VI clb3 Δ проявляли задержку деградации Securin / Pds1, расщепления когезина и удлинения веретена анафазы.Принимая во внимание
30-минутная задержка образования веретена в клетках clb2-VI clb3 Δ, задержка деградации Securin / Pds1, расщепления когезина и входа в анафазу оказались сходными между clb1Δ clb2-VI и clb2-VI clb3 Δ клетками. (Рис. 7A, B). Задержка у тройного мутанта была более выраженной (рис. 7A, B).

Чтобы определить, требуется ли активность Clb2 / 3-CDK для удлинения анафазного веретена независимо от деградации Securin / Pds1
и расщепление когезином, мы исследовали кинетику удлинения веретена в clb2-VI clb3 Δ клетках, лишенных NDC10 .Как и в клетках clb1Δ clb2-VI , удлинение веретена было сильно затруднено в клетках clb2-VI clb3 Δ (Рис. 7C-E; Дополнительный Рис. 3D). По сравнению с одиночным мутантом ndc10-1 , clb1Δ clb2-VI ndc10-1 проявлял 30-минутную задержку входа в митоз, в то время как clb2-VI clb3 Δ и clb2-VI clb3Δ ndc10-1 клетки демонстрировали 45-минутную задержку входа в митоз (фиг. 7C). Поэтому для сравнения кинетики удлинения митотического веретена между штаммами мы скорректировали графики так, чтобы
начало формирования биполярного веретена совпало (рис.7D). Измерения длины веретена в совпадающие моменты времени показали, что, в то время как клетки ndc10-1 достигли средней длины веретена 7,4 мкм, веретена в клетках ndc10-1 clb2-VI clb3 Δ и ndc10-1 clb1Δ clb2-VI достигли медианная длина составляет всего 5,3 и 4,9 мкм соответственно (рис. 7E; дополнительный рис. 3D). clb2-VI clb3 Δ клеток достигли средней длины веретена 3,2 мкм. Наши результаты показывают, что инактивация CLB2 и CLB3 вызывает такие же метафазные дефекты, как инактивация CLB1 и CLB2 .Более того, они предполагают, что общий уровень активности Clb-CDK важен для вступления в анафазу.

Обсуждение

Митотические CDK наиболее известны своей важной функцией в инициировании митоза, где они способствуют формированию митотического веретена,
конденсация хромосом и разрушение ядерной оболочки (Nigg 2001; Miele 2004).Функции этих киназ на более поздних стадиях митоза менее изучены. Здесь мы показываем, что активность Clb – CDK
запускает два ключевых аспекта сегрегации хромосом: (1) активация APC / C – Cdc20 для облегчения деградации секурина и (2)
удлинение веретена анафазы для облегчения разделения генома между будущими дочерними ядрами. Таким образом, получается
что митотическая активность CDK не только инициирует митоз, но и является ключевым регулятором хромосомной сегрегации.

Активность Clb – CDK необходима для активации APC / C – Cdc20 in vivo.

APC / C представляет собой большой комплекс убиквитин-лигазы E3 с молекулярной массой ~ 1,5 МДа, который у человека состоит по крайней мере из 12 субъединиц (13 в почковании.
дрожжи) (Peters 2006). Многие киназы, включая CDK, Polo-подобные киназы и PKA, фосфорилируют APC / C – Cdc20 in vitro и большинство этих фосфорилирований,
за исключением тех, которые катализируются PKA, как полагают, активируют APC / C – Cdc20 (Lahav-Baratz et al.1995; Kotani et al. 1998; Патра и Данфи 1998; Штейнберг и др. 1999; Kramer et al. 2000; Руднер и Мюррей 2000; Юдковский и др. 2000; Golan et al. 2002; Kraft et al. 2003; Searle et al. 2004; Herzog et al. 2005; Peters 2006). In vivo существует по крайней мере 51 сайт фосфорилирования в APC / C человека (Kraft et al. 2003). Такое большое количество сайтов препятствует мутационному анализу и, следовательно, функциональному значению этого фосфорилирования.
События остаются неизвестными.

В нашем исследовании мы обнаружили, что активность Clb-CDK необходима для своевременного разрушения APC / C-Cdc20 субстрата Securin / Pds1.Поскольку неспособность клеток clb1Δ clb2-VI расщеплять Securin / Pds1 не зависела от контрольных точек, которые, как известно, ингибируют APC / C – Cdc20, мы заключаем, что еще предстоит идентифицировать
Clb1 / 2-CDK-зависимый процесс регулирует функцию APC / C-Cdc20 или что активность Clb1 / 2-CDK напрямую контролирует активацию APC / C-Cdc20
in vivo. Мы поддерживаем последнюю возможность, потому что Руднер и Мюррей (2000) наблюдали, что штаммы, несущие версию APC / C, в которой все сайты фосфорилирования CDK в пределах субъединиц APC / C Cdc16,
Cdc23 и Cdc27 были мутированы в аланин (« apc / c-12A »), проявляют 15-минутную задержку в метафазе и требуют CLB2 для жизнеспособности (Rudner and Murray 2000).Учитывая, что задержка клеточного цикла мутанта apc / c-12A была умеренной по сравнению с таковой у штаммов clb1Δ clb2-VI или clb2-VI clb3 Δ, этот результат предполагает наличие дополнительных мишеней Clb-CDK. среди субъединиц APC / C – Cdc20. Cdc20 — вероятный кандидат
потому что человеческий Cdc20 фосфорилируется in vivo (Kraft et al. 2003). Что еще более важно, мутация четырех серинов в четырех консенсусных последовательностях CDK у почкующихся дрожжей Cdc20 в аланины
( cdc20-4A ) не влияет на функцию CDC20 в штамме дикого типа, но вызывает летальность в сочетании с мутантом apc / c-12A и остановку клеточного цикла в метафазе (R.Rahal, неопубликовано). Это наблюдение согласуется с идеей о том, что фосфорилирование
как Cdc20, так и APC / C важны для активации убиквитинлигазы в метафазе. Однако, поскольку у нас есть
до сих пор не удалось продемонстрировать, что четыре консенсусных сайта CDK в Cdc20 фосфорилируются in vivo, мы не можем
исключить возможность того, что аллель cdc20-4A является гипоморфным из-за структурных, а не регуляторных дефектов.

Митотическая активность CDK необходима для удлинения веретена во время анафазы

Делеция PDS1 в clb1Δ clb2-VI клетках выявила вторую важную функцию Clb1 / 2-CDKs в инициации анафазы. Несколько линий доказательств указывают на то, что
что активность Clb1 / 2-CDK не обеспечивает эту функцию посредством разрешения связей между сестринскими хроматидами. mcd1-1 штаммы не способны поддерживать сцепление сестринских хроматид, а аллель mcd1-1 подавляет дефект входа в анафазу мутантов APC / C – Cdc20 и Separase (Guacci et al. 1997; Severin et al. 2001b). Однако в штаммах clb1Δ clb2-VI подавление дефекта входа в анафазу инактивацией когезина было лишь частичным. Мы интерпретируем это
частичное спасение в результате того факта, что мутация mcd1-1 обходит дефект деградации Securin / Pds1 штаммов clb1Δ clb2-VI , позволяя произойти некоторому удлинению веретена (из-за отсутствия когезии сестринских хроматид, которая обычно сопротивляется микротрубочкам).
тянущие силы).Тем не менее, веретена клеток mcd1-1 clb1Δ clb2-VI никогда не удлинялись полностью до длины, наблюдаемой в клетках mcd1-1 , что указывает на то, что активность Clb1 / 2-CDK необходима не только для удаления когезии, чтобы вызвать движение хромосом.
Устранение репликации ДНК также не позволило удлинить веретено у штаммов clb1Δ clb2-VI , что дополнительно исключает возможность того, что независимые от когезина связи ответственны за веретено анафазы.
дефект элонгации клеток, лишенных активности Clb1 / 2 – CDK.

Эти находки позволяют сделать вывод, что сам процесс удлинения веретена требует активности Clb1 / 2-CDK. Этот
Идея подтверждается наблюдением, что устранение функции кинетохор не способствовало удлинению веретена анафазы B.
в штаммах clb1Δ clb2-VI . Тот же результат был получен в клетках, лишенных активности Clb2 / 3-CDK, что указывает на неспецифичность этого требования.
к паре поздних митотических циклинов Clb1 и Clb2.На первый взгляд, идея о том, что активность Clb – CDK необходима для удлинения веретена
может показаться парадоксальным, поскольку митотическая активность CDK начинает снижаться по мере того, как клетки входят в анафазу. Однако важно
отметим, что, по крайней мере, у дрожжей снижение митотической активности CDK не требуется для удлинения веретена анафазы. Сверхэкспрессия
недеградируемой версии Clb2 не мешает удлинению веретена (Surana et al. 1993). Также стоит отметить, что наши данные не ставят под сомнение начало снижения митотической активности CDK.
с активацией APC / C – Cdc20.Они просто указывают на то, что для анафазы требуется определенное количество активности Clb-CDK.
удлинение веретена, которое не встречается в клетках, лишенных активности Clb1 / 2-CDK или Clb2 / 3-CDK.

Как активность Clb-CDK способствует удлинению веретена во время анафазы?

Наш анализ с помощью электронной микроскопии показал, что биполярные веретена, образованные клетками clb1Δ clb2-VI , выглядят нормально в общей структуре, что указывает на то, что общий структурный дефект не является причиной неспособности
клеток, лишенных активности Clb1 / 2-CDK, чтобы удлинять свои веретена.Ранее было показано, что протеинфосфатаза Cdc14
необходимы для своевременного удлинения анафазного веретена и перехода от метафазной динамики микротрубочек к анафазной (Higuchi and Uhlmann 2005). Дефект удлинения веретена анафазы у мутантов cdc14 , однако, незначителен по сравнению с дефектом клеток clb1Δ clb2-VI или clb2-VI clb3 Δ. Это открытие указывает на то, что роль Clb-CDK в удлинении веретена анафазы не может быть объяснена его функцией в
Активация Cdc14 при переходе метафаза – анафаза (Azzam et al.2004 г.). Также маловероятно, что Clb-CDK способствуют удлинению веретена благодаря своей роли в активации APC-Cdc20, поскольку высокие уровни
Cdc20 подавляют дефект деградации Securin / Pds1 клеток clb1Δ clb2-VI , но не дефект удлинения веретена штамма (R. Rahal, неопубликованный).

Удлинение шпинделя в анафазе происходит в два этапа: начальная быстрая фаза, в которой шпиндель удлиняется до ∼3–4 мкм, затем
на второй фазе, на которой веретено медленно удлиняется до конечной длины ~ 7-8 мкм (Yeh et al.1995; Straight et al. 1997, 1998; Пирсон и др. 2001). Микроскопия живых клеток показала, что веретена в клетках mcd1-1 clb1Δ clb2-VI прошли циклы быстрого удлинения веретена на длину от 3 до 4 мкм, за которым последовал коллапс веретена.
и реформация. Это открытие открывает интересную возможность того, что вторая, медленная фаза элонгации нарушается в клетках mcd1-1 clb1clb2-VI . Эта медленная стадия удлинения может потребовать Clb-CDK-опосредованных изменений моторной функции микротрубочек.Мы попытались протестировать
эта гипотеза несколькими способами, но ни избыточная экспрессия факторов, способствующих удлинению веретена, таких как CIN8 (Hildebrandt and Hoyt, 2000) или STU2, (Severin et al. 2001a; Krishnan et al. 2004), ни делеция ингибиторов удлинения веретена, таких как KIP3 (Хильдебрандт и Хойт, 2000; Гупта и др., 2006; Варга и др., 2006) исправил дефект удлинения веретена у клеток clb1Δ clb2-VI и клеток mad1Δ mcd1-1 clb1Δ clb2-VI (дополнительный рис.6; данные не показаны). Мы поддерживаем гипотезу о том, что активность Clb – CDK запускает удлинение веретена за счет
регулируют активность множества моторов и / или белков, связанных с микротрубочками, особенно тех, которые находятся в средней зоне веретена.
В связи с этим интересно отметить, что мутация девяти консенсусных последовательностей CDK в хромосомном белке-пассажире
Bir1 в аминокислоты, которые больше не могут быть фосфорилированы, снижает степень удлинения веретена и предотвращает локализацию
белков, таких как Ndc10, в среднюю зону веретена во время анафазы (Widlund et al.2006 г.). Мы предполагаем, что Clb-CDK-зависимое рекрутирование белков в среднюю зону веретена может быть важным для полной анафазы.
удлинение шпинделя.

Важна ли активность Clb-CDK или специфичность Clb-CDK (или обе)?

Один из ключевых вопросов, возникающих из наших данных, заключается в том, существуют ли различия в субстратной специфичности шести циклинов Clb или изменения
в общих уровнях активности Clb-CDK необходимы для осуществления различных митотических переходов.Клетки, лишенные Clb2 / 3 – CDK
активность проявляет задержку в формировании биполярного веретена, фенотип, который не характерен для клеток, лишенных активности Clb1 / Clb2-CDK,
повышая вероятность того, что разные Clb-CDKs выполняют разные митотические события. Однако несколько других наблюдений утверждают, что
для увеличения количества активности Clb-CDK, запускающей последовательные митотические события. Во-первых, инактивация не только CLB1 и CLB2 , но также CLB2 и CLB3 вызывает задержку деградации Securin / Pds1 и нарушение удлинения анафазного веретена.Во-вторых, делеция CLB2 и CLB4 также приводит к задержке митоза (Fitch et al., 1992; Richardson et al., 1992), тогда как при делеции CLB1 , CLB3 и CLB4 нельзя различить фенотип (Fitch et al. 1992; Richardson et al. 1992). Учитывая, что почти 70% митотической активности CDK связано с Clb2 (Surana et al. 1991), похоже, что степень задержки метафазы коррелирует с уровнем активности CDK, связанной с конкретным
циклин.Кроме того, мы обнаружили, что экспрессия CLB3-HA с промотора CLB2 устраняет дефект входа в анафазу клеток clb1Δ clb2-VI в той же степени, что и экспрессия CLB2-HA с промотора CLB2 ( Дополнительный рис.7). При условии, что эффекты метки эпитопа НА на Clb2 и Clb3 одинаковы (оба метки
версии белков не полностью функциональны) (дополнительный рисунок 7; данные не показаны), этот результат указывает на то, что Clb2
и Clb3 сходны по своей способности способствовать прогрессированию через митоз.В этой «количественной модели Clb» дефект в
Формирование биполярного веретена, которое кажется уникальным для клеток, лишенных активности Clb2 / 3-CDK, можно объяснить тем фактом, что CLB3 экспрессируется раньше во время клеточного цикла и, таким образом, обеспечивает уровень активности Clb-CDK (с Clb2), необходимый для
своевременное формирование биполярного веретена. Мы предполагаем, что изменения общих уровней Clb-CDK вызывают последовательные митотические события,
но не исключает возможности того, что существуют незначительные различия в предпочтении субстрата среди разных митотических Clb-CDK.

Модель того, как повышение активности CDK во время раннего митоза устанавливает порядок митотической прогрессии

Ранее предполагалось, что увеличение количества CDK устанавливает последовательные события клеточного цикла, при этом низкие уровни CDK способствуют
S-фаза и высокие уровни CDK, запускающие M-фазу (Stern and Nurse 1996).Наши данные показывают, что возрастающие количества Clb-CDKs также ответственны за запуск последовательных митотических событий. Инактивация
из CLB1 и CLB2 не вызывает задержки в развитии клеточного цикла до метафазы, тогда как инактивация CLB2 и CLB3 вызывает умеренную 30-минутную задержку. Напротив, инактивация CLB1 , CLB2 , CLB3 и CLB4 вызывает остановку клеточного цикла в G2 с реплицированной ДНК и неразделенными SPB (Surana et al.1991; Fitch et al. 1992; Ричардсон и др. 1992; Amon et al. 1993). Более того, активность Clb-CDK возрастает по мере продвижения клеток через митоз (Surana et al. 1991; Fitch et al. 1992; Richardson et al. 1992; Surana et al. 1993). Основываясь на этих наблюдениях, мы предполагаем, что для перехода в анафазу необходимы более высокие уровни митотической активности CDK.
чем для вступления в митоз (рис. 8). Этот устойчивый рост митотической активности CDK помогает установить порядок событий во время раннего митоза с более низким порогом
активности Clb-CDK, запускающей вход в митоз, и второй, более высокой активности, запускающей вход в анафазу.Наконец, однажды анафаза
вход был инициирован, протеолиз Clb вызывает снижение активности Clb-CDK, запускающий выход из митоза (во время которого
пороговые значения также могут иметь значение) (Wolf et al. 2007). Интересно, что увеличение количества митотической активности CDK также может управлять прогрессированием через ранние стадии митоза у
клетки млекопитающих. Митотическая активность CDK возрастает по мере того, как клетки переходят из G2 в метафазу (Arion et al. 1988; Labbe et al.1988, 1989; Готье и др. 1989; Мюррей и Киршнер 1989; Линдквист и др. 2007). Кроме того, полная инактивация Cdk1 методами на основе РНКи предотвращает вступление в митоз, тогда как частичная инактивация Cdk1
задерживает вход в анафазу (Lindqvist et al. 2007). Следовательно, требование устойчивого повышения митотической активности CDK для митотической прогрессии может быть общим механизмом, с помощью которого
все эукариотические клетки гарантируют, что сегрегация хромосом происходит только после того, как хромосомы конденсируются и митотическое веретено
сформировалась.

Рисунок 8.

Модель того, как возрастающие уровни активности CDK помогают установить порядок ранних митотических событий. См текст для деталей.

Материалы и методы

Все штаммы были производными штамма W303 (K699) и перечислены в дополнительной таблице 1.Условия роста для каждого эксперимента
описаны в подписях к рисункам. Вестерн-блоттинг Pds1-HA, Scc1-18Myc и Pgk1 выполняли, как описано в
Коэн-Фикс и др. (1996), Uhlmann et al. (1999) и Monje-Casas et al. (2007) соответственно. Непрямую иммунофлуоресценцию тубулина проводили, как описано в Monje-Casas et al. (2007). Измерения длины шпинделя проводились с использованием программы визуализации Openlab 3.0.2. Были проведены эксперименты по истощению запасов Cdc6.
как описано у Биггинса и Мюррея (2001).Электронно-микроскопический анализ клеток выполняли, как описано в Winey et al. (2005). Вкратце, циклические культуры клеток дикого типа (A1411) и clb1Δ clb2-VI (A3000), каждая из которых несет слияние Cdc14-3HA, выращивали в течение ночи, а затем переносили на 3 часа в водяную баню при 37 ° C. Клетка
культуры были профильтрованы в пасту и немедленно заморожены под высоким давлением с использованием морозильника Leica EM PACT 2. Клетки были заморожены.
в 2% четырехокиси осмия и 0.1% уранилацетата при -80 ° C, затем медленно нагревали до комнатной температуры и заливали в TAAB Epon.
Срезы собирали на медных сетках и окрашивали 2% уранилацетатом в ацетоне и цитратом свинца. Разделы были
∼80 нм толщиной. Визуализацию выполняли с использованием микроскопа Tecnai G 2 Spirit BioTWIN (FEICompany) и камеры 2k CCD (AMT).

Для визуализации живых клеток клетки задерживали в G1 в YEPD с α-фактором (5 мкг / мл) в течение 2 часов при комнатной температуре, а затем помещали
в водяной бане с 37 ° C в течение 30 мин при α-факторе.Затем клетки высвобождали, как показано на рисунке 1B. Через 30 минут после высвобождения клетки кратковременно обрабатывали ультразвуком и 5 мкл клеток помещали в камеру для визуализации (Lab-Tek chambered
покровное стекло) под толстой подушечкой из 4% агара-CSM (полностью синтетической среды), чтобы ограничить их движение. Триста микролитров
CSM, предварительно нагретого до 37 ° C, затем добавляли в камеру для визуализации. Визуализацию выполняли при 37 ° C на DeltaVision RT (прикладной
Прецизионный) микроскоп с планом Apo 100 × -NA 1.4 масляных объектива (Olympus) с фильтрами FITC (возбуждение 488 нм / эмиссия 528 нм),
камеру Photometrics CoolSNAP HQ (Roper Scientific) и программное обеспечение softWoRx (Applied Precision). Время экспозиции 200
мс, и изображения были разделены по два. Различные штаммы были визуализированы в отдельные дни, потому что только одна группа клеток могла
соблюдаться во время каждого временного курса визуализации.

Благодарности

Мы благодарны Керри Блуму, Энди Хойту, Эндрю Мюррею, Адаму Руднеру и Сью Биггинс за штаммы, реагенты и советы.Мы благодарим Элизу Василе из центра MIT CCR Microscopy and Imaging за ее помощь с микроскопией живых клеток. Благодарим Марию
Эрикссон и Элизабет Бенекки из отделения ЭМ Гарвардской медицинской школы за помощь в анализе ультраструктуры шпинделя.
Мы благодарим Андреаса Хохвагена, Фрэнка Соломона и сотрудников лаборатории Амона за их критическое прочтение рукописи.
Работа поддержана грантом GM 56800 Национального института здравоохранения.А.А. также является следователем Ховарда Хьюза.
Медицинский институт.

S&T LRBAA | Национальная безопасность

Объявление долгосрочного агентства по науке и технологиям (LRBAA) — это постоянное открытое приглашение научному и техническому сообществу финансировать новаторские проекты в области исследований и разработок (НИОКР) в поддержку безопасности нашей страны.Его цель — продвигать наши научные и технические знания и применять эти достижения в операционной среде департамента.

Традиционное объявление широкого агентства (BAA) довольно специфично по своим предметным требованиям. LRBAA — нет. По дизайну он охватывает широкий круг вопросов и не содержит деталей. Это позволяет S&T обдумывать предложения по оригинальным исследованиям, выходящие за рамки его более узко определенных BAA. Чтобы просмотреть список текущих запросов S&T, посетите портал запросов S&T.

Чтобы узнать больше о процессе подачи заявок в LRBAA и текущих запросах, посетите веб-сайт LRBAA S&T и портал запросов.

объявляет о новых возможностях финансирования через LRBAA!

DHS S&T недавно выпустило ежегодное объявление о LRBAA и предлагает вам узнать больше о наших новых темах и предложить новые решения для поддержки потребностей DHS в исследованиях и разработках. В этом объявлении упоминаются 23 темы, в том числе одиннадцать новых, две обновленные темы и десять постоянных тем.

Текущие темы LRBAA

Текущие 23 темы LRBAA разделены на шесть приоритетных областей НИОКР:

ОБЕСПЕЧЕНИЕ АВИАЦИИ (ТРЦ AVN)

  • SEC AVN 02-04: Инструменты для рентгеновского скрининга (новые)
  • SEC AVN 02-05: Просеивание плотного материала в грузовых салазках (новый)
  • SEC AVN 04-08: Улучшенный контакт и бесконтактный отбор проб и обнаружение следов взрывчатых веществ
  • SEC AVN 05-02: Скрининг на скорости (новый)

БЕЗОПАСНЫЕ ГРАНИЦЫ (SEC BORD)

  • SEC BORD 01-01: Неинвазивные, минимально разрушающие датчики и системы (новые)
  • SEC BORD 03-05: Технологии воздушного базирования
  • SEC BORD 03-06: Противодействие беспилотным авиационным системам (обновлено)
  • SEC BORD 03-07: Технологии осведомленности в морской сфере (новый)
  • SEC BORD 06-01: Биометрические технологии для расширения, расширения или улучшения возможностей идентификации и проверки DHS (новый)

БЕЗОПАСНОЕ КИБЕРПРОСТРАНСТВО (SEC CYB)

  • SEC CYB 03-01: Распределенная защита от отказа в обслуживании (DDoSD)
  • SEC CYB 03-04: Прогностическая аналитика
  • SEC CYB 04-02: Исследования и разработки в области мобильной безопасности и отказоустойчивости
  • SEC CYB 06-01: Software Assurance

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ ТЕРРОРИЗМА (ПРЕД)

  • PREV 01-02: Detection Canine Technologies (новый)
  • PREV 04-02: Технология смягчения тарана транспортных средств
  • PREV 04-03: Предотвращение угроз

ЗАЩИТА ОТ ТЕРРОРИСТИЧЕСКИХ АТАК (ЗАЩИТА)

  • PROT 02-01: Data Analytics (новый)
  • PROT 03-02: Профилактика, диагностика и смягчение последствий трансграничных сельскохозяйственных вредителей и болезней (новый)

УПРАВЛЕНИЕ ИНЦИДЕНТАМИ (MGMT)

  • MGMT 01-02: Принятие технологии (новый)
  • MGMT 02-01: Устойчивое положение, навигация и время (PNT)
  • MGMT 02-05: Недорогие тактические устройства связи для обмена информацией в удаленных средах (решение Border Security Technology)
  • MGMT 02-08: Риск критической инфраструктуры GMD и ядерного EMP (обновлено)
  • MGMT 08-03: Передовые вычислительные технологии (новый)

Обзор

Программы

S&T и Component могут получать материалы концепции исследования через веб-сайт LRBAA и портал запросов.Веб-сайт содержит актуальные темы исследований, ссылки на запрос LRBAA 18-01 FedBizOps и информацию о том, как подать заявку на участие в теме. Потенциальным источникам настоятельно рекомендуется прочитать весь текст запроса.

Модернизированный LRBAA DHS S&T выделяется:

  • Прозрачное упрощенное объявление с подробностями
  • Оптимизированные и эффективные процедуры подачи заявок
  • Уведомление о заинтересованности DHS в вашем исследовании в течение 10 дней
  • Гибкое общение, включая диалог с руководителями тематических программ, виртуальную презентацию и отправку дополнительного видео

Компании любого размера, университеты, национальные лаборатории и другие научно-исследовательские организации (как внутренние, так и международные) могут подавать идеи через LRBAA.Приводя темы в соответствие с наиболее приоритетными потребностями, LRBAA обеспечивает механизм, позволяющий сосредоточить уникальные возможности и опыт нашей партнерской базы на решении критических проблем внутренней безопасности Компонента.

Успешные заявки в LRBAA отвечают на такие вопросы, как «Какую исследовательскую задачу вы предлагаете решить? Чем ваша концепция отличается от решений, доступных в настоящее время в других странах, и превосходит их? Какие данные и анализ у вас есть, чтобы подтвердить утверждение о том, что финансирование вашего проекта НИОКР приведет к значительному увеличению возможностей DHS? »

  • LRBAA не выделяется заранее определенный уровень финансирования.Таким образом, предоставление средств является важным фактором при оценке многообещающего предложения.
  • Продукты, которые доступны на коммерческом рынке, или услуги поддержки любого рода не могут рассматриваться или приобретаться через LRBAA в соответствии с Положением о федеральных закупках.
  • LRBAA предназначен специально для оригинальных, современных исследований или уникальных прототипов, требующих подтверждения концепции.
  • Все материалы проходят рецензирование.

Видео LRBAA

Управление науки и технологий Департамента внутренней безопасности (DHS) модернизировало свои процессы и процедуры LRBAA с целью повышения их ценности и использования как для Департамента, так и для наших партнеров из отрасли и академических кругов. Узнайте больше о модернизированном LRBAA в видео ниже.

Агентство дальнего радиуса действия Объявление о модернизации

S&T в партнерстве с отделом главного закупщика DHS улучшила методы ведения бизнеса LRBAA, чтобы упростить для промышленности сотрудничество с S&T и предоставить инновационные решения для предприятий внутренней безопасности.В новом LRBAA предусмотрены прозрачные коммуникации, упрощенный процесс подачи и рассмотрения, а также сокращены сроки подачи заявок до присуждения контрактов на пять месяцев. В этом видео старший сотрудник DHS S&T, выполняющий обязанности заместителя секретаря Билла Брайана и главный специалист по закупкам DHS Сорая Корреа, обсуждают совместные усилия по модернизации LRBAA и улучшения веб-сайта LRBAA.

Веб-семинар по отраслевым обновлениям для агентств дальнего радиуса действия

Благодаря улучшениям, обусловленным вовлечением отрасли и охватом, S&T модернизировала процессы и процедуры LRBAA, чтобы расширить участие отрасли и более точно согласовать темы с приоритетами DHS.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *